[发明专利]一种靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种靶向间充质干细胞外泌体，其特征在于；该靶向间充质干细胞外泌体的配方包括以下组份：间充质干细胞15％-25％、氨基酸1-2％、葡萄糖3-8％、无水氯化钙1-5％、亮氨酸3-6％、氯化钾2-4％、次黄嘌呤1-2％、胸苷1-3％、核黄素2-6％、苯丙氨酸4-8％、氯化钠0.09-2％、乳酸钠0.1-2％、氯化钙0.09-2％、必须氨基酸0.01-5％、非必须氨基酸0.01-5％、人血清白蛋白0.1-5％，其余为去离子水。

2.根据权利要求1所述的一种靶向间充质干细胞外泌体，其特征在于：包括间充质干细胞15％、氨基酸2％、葡萄糖3％、无水氯化钙5％、亮氨酸6％、氯化钾4％、次黄嘌呤2％、胸苷3％、核黄素2％、苯丙氨酸8％、氯化钠0.09％、乳酸钠0.1％、氯化钙2％、必须氨基酸5％、非必须氨基酸0.01％、人血清白蛋白5％，其余为去离子水。

3.根据权利要求1所述的一种靶向间充质干细胞外泌体，其特征在于：包括间充质干细胞18％、氨基酸1.8％、葡萄糖4％、无水氯化钙4％、亮氨酸5％、氯化钾3％、次黄嘌呤2％、胸苷2％、核黄素3％、苯丙氨酸7％、氯化钠1％、乳酸钠1％、氯化钙1％、必须氨基酸4％、非必须氨基酸1％、人血清白蛋白4％，其余为去离子水。

4.根据权利要求1所述的一种靶向间充质干细胞外泌体，其特征在于：包括间充质干细胞20％、氨基酸1.5％、葡萄糖6％、无水氯化钙3％、亮氨酸4％、氯化钾2％、次黄嘌呤1％、胸苷1.5％、核黄素4％、苯丙氨酸5％、氯化钠1.5％、乳酸钠1.5％、氯化钙2％、必须氨基酸3％、非必须氨基酸3％、人血清白蛋白2％，其余为去离子水。

5.根据权利要求1所述的一种靶向间充质干细胞外泌体，其特征在于：包括间充质干细胞25％、氨基酸1％、葡萄糖8％、无水氯化钙1％、亮氨酸3％、氯化钾2％、次黄嘌呤2％、胸苷1％、核黄素6％、苯丙氨酸4％、氯化钠2％、乳酸钠2％、氯化钙0.09％、必须氨基酸0.01％、非必须氨基酸0.01％、人血清白蛋白0.1％，其余为去离子水。

6.一种如权利要求1-5任意一条所述的靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：

S1：定量称取，将所有的原料按照上述的组份进行称取；

S2：间充质干细胞培养，将间充质干细胞、氨基酸、葡萄糖、无水氯化钙、亮氨酸、氯化钾、次黄嘌呤、胸苷、核黄素、苯丙氨酸全部倒入一容器中，用少量注射用水将盛有这些物质的袋内残留培养基洗下，并入容器中，加注射用水(水温19℃～31℃)到950毫升，轻微搅拌溶解；将采集的人关节液间充质干细胞转移至生物安全柜内，倒入装有含青霉素的胎牛血清中，使用胎牛血清对人关节液间充质干细胞进行清洗；染色标记，使用荧光抗体标记细胞，应用FlowSight流式细胞仪鉴定关节液间充质干细胞，并观察其单细胞形态和荧光染色情况，取上清液；

S3：除菌，取步骤二中得到的制剂送入除菌级亲水性过滤器中过滤除菌；亲水性过滤器的孔径为0.1～1μm；

S4：囊泡颗粒分离，通过高速离心法(差速离心)分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，提取上清液，10000g，4度，离心25-29分钟，0.22微米膜过滤后；提取上清液，10000g，4度，离心60-68分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀；提取上清液，10000g，4度，62-66分钟，弃上清，用400ul左右PBS重悬获得外泌体；

S5：重悬处理，利用乳酸钠林格注射液对步骤三得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；

S6：获取分泌体制剂，靶向间充质干细胞外泌体在步骤五得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠、乳酸钠、氯化钙、必须氨基酸、非必须氨基酸、人血清白蛋白，即为所制备的外泌体生物制剂；

S7：注射使用，取出制剂保存管，然后使用注射器进行消毒，注射器吸入制剂保存管中的制剂，注射到患者关节处即可。