[发明专利]非疾病诊断目的的非衍生化准确定量血清中C肽的方法

说明书

本发明公开了一种非疾病诊断目的的非衍生化准确定量血清中C肽的方法，从提高C肽提取源头效率出发，使其能够不通过衍生化处理就可以进一步提高方法定量限。从增加抗体和抗原的接触面积，确定抗原和磁珠的接触方向为出发点，制备了多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠的复合材料。将制备的PVDF模板分散免疫磁珠复合材料应用于C肽定量限考察，通过与未分散免疫磁珠对比，用PVDF模板分散免疫磁珠复合材料提取C肽纯品后将定量限由柱上0.3ng降低至0.05ng，与日本计量院发表的C肽潜在参考测量程序相比，不通过衍生化处理后就能达到定量正常人血清C肽的目标，简化了检测流程，同时减少了磁珠和抗体的用量。

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，特别是涉及一种非衍生化准确定量血清中C肽的方法。

背景技术

测定C肽的浓度能得知胰岛细胞的功能，对糖尿病的诊断和治疗具有重要的意义。C肽商业化的免疫测定方法是通过C肽免疫反应活性来测定C肽浓度，但是通常会出现检测值偏高的情况。同位素稀释质谱法时能够区别内源和外源蛋白质，从而能直接准确的测定目标物质。日本计量院将6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)修饰C肽N端氨基，氨基喹啉基可以通过在肽段中添加正电荷来提高电离效率，化学修饰和磁珠免疫提取法提高了血清中C肽的定量限，其柱上0.003～2.9ng范围内线性关系良好，相对标准偏差为4.0％，加入NMIJ CRM 6901-b作为标准物质，提供了一种潜在的C肽标准测量程序，但是该方法流程复杂，会影响结果准确度。

目前，在同位素稀释质谱法的样品前处理中，蛋白质类样品通常是通过抗原和抗体免疫结合进行分离，其特异性和高效性为提取低丰度复杂基质中样品提供了便捷途径。因此将具有超顺磁性物质的表面包覆不同的官能团与抗体或抗原进行共价或非共价结合，既可以发挥抗原抗体的特性结合优势，又可以发挥超顺磁性物质的特点，通过磁场的改变达到混合均匀、高效分离和基质残留量少的目的。目前的研究都集中在建立颗粒表面功能化和探索固定抗体最优方法方面，以达到特异性富集和获得最佳提取效率的目的。由于磁性粒子可以用不同的合成方法来制备，它们的大小和理化性质有很大的差异，这限制了对抗体可靠结合能力的预测。因此，定量控制颗粒的可变性和功能化，开发通用的分析方法来准确定量结合抗体的数量是非常重要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种非疾病诊断目的的非衍生化准确定量血清中C肽的方法。从提高C肽提取源头效率出发，使其能够不通过衍生化处理就可以进一步提高方法定量限。从增加抗体和抗原的接触面积，确定抗原和磁珠的接触方向为出发点，制备多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠的复合材料。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种非疾病诊断目的的非衍生化准确定量血清中C肽的方法，包括以下步骤：

(1)模板分散免疫磁珠复合材料的制备；(2)血清中C肽的定量。

其中，模板分散免疫磁珠复合材料的制备步骤具体为：

通过法制备单分散SiO₂微球，室温干燥后在30％过氧化氢中浸泡12h，真空干燥后丁二酸改性备用；

将载玻片在使用前用质量分数为30％的过氧化氢和质量分数为98％的浓硫酸的混合溶液中浸泡静置12h，再经去离子水反复漂洗后在氮气流中干燥备用；其中，过氧化氢和浓硫酸的体积比3:7。

用去离子水配成质量分数为2％SiO₂分散溶液，超声分散转移至染色缸中；将过氧化氢和浓硫酸混合溶液处理后的载玻片插入染色缸中垂直置于悬浮液中，真空干燥后取出载玻片。

将2g PVDF粉末溶解在10mL二甲基亚砜中，搅拌均匀，滴适量在SiO₂浸渍后的载玻片上，保持均匀，在60℃烘箱中干燥6h，取出后浸泡在去离子水中，膜自动与载玻片分离；