[发明专利]一种EGFR靶向性的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及其制备方法、应用

说明书

本发明提供一种EGFR靶向性的嵌合抗原受体，EGFR靶向性的嵌合抗原受体包括抗EGFR抗体的抗原结合域，抗EGFR抗体的抗原结合域表达为EGFRscFv，EGFRscFv的核酸序列为SEQ ID NO:2。本发明还提供了CAR‑NK细胞及其制备方法，使NK细胞表达EGFR靶向性的嵌合抗原受体的EGFRscFv，得EGFR靶向性的CAR‑NK细胞。本发明还提供一种组合物、抗癌剂、应用。本发明提供的EGFR靶向性的CAR‑NK细胞对三阴性乳腺癌EGFR靶点具有特异识别性，靶向杀伤EGFR阳性三阴性乳腺癌癌细胞并促进细胞因子的释放。CAR‑NK细胞作为效应细胞识别肿瘤时，不需要自身白细胞抗原与肿瘤匹配，不会产生移植物抗宿主反应。CAR‑NK疗法不会引发细胞因子风暴，更安全。CAR‑NK细胞来源广泛，如外周血单个核细胞、诱导多能干细胞、脐带血、人类胚胎干细胞和NK‑92细胞系。

技术领域

本发明涉及生物与医药技术领域，尤其涉及一种EGFR靶向性的嵌合抗原受体、CAR-NK 细胞及其制备方法、应用。

背景技术

据2018全球癌症年报统计，乳腺癌依旧是女性中发病率最高的癌症类型，仅在2018 年，全球新增2088849个乳腺癌病例，死于乳腺癌的女性患者达到626679例。据《2019年全国癌症报告》及《2018中国肿瘤登记年报》统计，我国乳腺癌新发病例约为279000 例，死亡病例约为66000例。预计2021年，我国乳腺癌患者将达250万。乳腺癌严重危害患者生命和生活质量，同时治疗费用及相关社会经济问题给个人和国家带来沉重负担。但由于特定历史、经济等原因，我国医药产业基础弱于欧美，创新型药物及治疗手段长期依赖于进口和模仿。随着知识产权的保护及限制，模仿不可能成为我国医药发展的长期目标。因而建立具有自主知识产权的创新型药物、创新型疗法成为我国现阶段医药发展的当务之急。

乳腺癌在不同患者中差异很大，差异体现在临床诊断、形态发生和分子分型中。按照组织分期、肿瘤体积、淋巴结浸润、受体特征和信号通路等，乳腺癌可以被分成多种类型。根据雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone Receptor,PR)和人表皮生长因子受体2(Erb-B2 Receptor Tyrosine Kinase 2,HER2)的表达情况，可以将乳腺癌分为ER+、HER2+和三阴性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC)三种类型。在临床中ER+、HER2+乳腺癌患者术后一般采用内分泌治疗或特异性靶向治疗，效果良好。由于缺乏ER、HER2靶点，三阴性乳腺癌恶性程度高，且在临床中尚无特异性靶向治疗药物，化疗和放疗是手术后主要干预手段。但这些疗法的细胞毒性通常会导致患者产生严重的不良反应，如全血细胞减少、恶心和腹泻等。此外，经过化疗或放疗三阴性乳腺癌患者的复发率也显著高于其它类型的乳腺癌患者。因此，为三阴性乳腺癌患者寻找高效且低副作用的治疗策略成为临床科研重点。

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)是酪氨酸激酶亚家族的成员，通过与其配体结合可诱导EGFR同二聚化或异二聚化，促使其酪氨酸激酶结构域自磷酸化，进一步激活下游信号通路(如：PI3K/AKT信号通路，Ras/Raf/MEK/ERK信号通路)，行使其生物学功能。随着对三阴性乳腺癌研究的深入，发现EGFR在45％—70％三阴性乳腺癌中异常高表达，且EGFR表达高低与乳腺肿瘤大小和预后直接相关。大量研究显示，EGFR在中国、日本、韩国、欧洲、澳洲、美洲三阴性乳腺癌患者中突变率极低，仅有的基因突变几乎都发生在EGFR酪氨酸激酶结构域的第19和21外显子编码部分，而非胞外结构域编码区。所以野生型EGFR几乎可以作为全球通用EGFR阳性乳腺癌直接治疗靶点，目前临床中针对于EGFR阳性乳腺癌治疗药物主要包括单克隆抗体类和小分子抑制剂类，且60％以上的病人对这两类药物有反应。但由于二次突变、其他激酶改变及反馈调节等原因，在抗EGFR治疗过程中也会出现耐药、不敏感等现象，严重制约治疗效果 [33,34]。因而，为EGFR阳性三阴性乳腺癌患者寻找新的治疗方案和可替代手段，成为科研工作者和医护工作者工作重点。