[发明专利]Slc12a9基因敲除小鼠模型及其建立方法和用途

说明书

本发明提供了一种Slc12a9基因敲除模型小鼠，及其培育方法和该小鼠模型在研究高血压的发病机制中的用途。所述模型小鼠是敲除了SLC12A9基因中的第5号外显子、第6号外显子和第7号外显子。本发明所述培育方法简单，且模型制作简单，重复性好；制作成本低。在临床表现与人类高血压相似，所述可用于人类高血压的研究，对阐明高血压的发病机制有重要的实际意义。研究还显示该模型为肿瘤的研究提供一种新的模型，可以作为预测脑胶质瘤患者预后的指标。因此，具有良好的推广应用价值。

技术领域

本发明涉及小鼠模型，尤其是Slc12a9基因敲除鼠的培育方法及该小鼠模型的用途。

背景技术

高血压会影响我们的动脉、心脏等重要器官和结构。长期发展下去，还会造成心梗、中风等危及生命的症状。我国高血压患病率以达到23％，目前，导致高血压的机制尚不明确。

Slc12a9广泛分布体内细胞的细胞膜上，介导细胞内外的钠离子，钾离子，氯离子的转运，与细胞内外的渗透压等密切相关。SLC家族蛋白在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。现有技术中，Slc12a9基因位于5号染色体，基因组长 19040kb，有14个外显子，其转录本为19.040kb，编码914个氨基酸。目前国际上未见Slc12a9与高血压的报道，建立Slc12a9基因敲除小鼠模型，对阐明高血压的发病机制有重要的实际意义。

发明内容

基于现有技术的状况，本发明提供了一种模型小鼠，为Slc12a9基因敲除小鼠。

进一步的，敲除了SLC12A9基因的中的第5号外显子、第6号外显子和第7号外显子。

本发明还提供了一种建立Slc12a9基因敲除小鼠模型的方法，包括以下步骤：针对小鼠SLC12A9基因，设计基因敲除策略，敲除区域选择：第5号外显子、第6号外显子和第7号外显子；采用CRISPR-Cas9基因编辑方法，获得F0代小鼠；将阳性F0代小鼠和C57BL/6J配繁后，得到具有Slc12a9基因敲除的阳性 F1代小鼠SLC12A9Slc12a9。

进一步的，所述CRISPR-Cas9基因编辑方法包括分别设计和构建5S1 sgRNA 和3S1sgRNA，并进行体外活性测试，制备Cas9混样体系；并将sgRNA与Cas9 蛋白结合，引导Cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。

本发明还建立Slc12a9基因敲除小鼠模型的方法，包括以下步骤：

(1)针对小鼠SLC12A9基因，设计基因敲除策略，敲除区域选择：第5号外显子、第6号外显子和第7号外显子；

(2)分别设计和构建5S1 sgRNA和3S1 sgRNA，并进行体外活性测试，制备Cas9混样体系；

(3)将cas9混样体系混合注射到受精卵中，移植，获得F0代小鼠；

(4)将阳性F0代小鼠和C57BL/6J配繁后，得到具有Slc12a9基因敲除的阳性F1代小鼠SLC12A9Slc12a9。

进一步的，所述5S1 sgRNA和3S1 sgRNA分别为5S1：CTCGCAGACCAAACAACTCC； 3S1：CTACTATTATAGAGAGTTTG。

进一步的，所述cas9混样体系包括5S1和3S1两条sgRNA和cas9。

进一步的，cas9混样体系中包括Cas9蛋白20ng/μl,两条sgRNA浓度是各 10ng/μl。

进一步的，阳性F1带小鼠用于保种建系，不同的保种建系之间原则上不允许交配。

本发明还提供了Slc12a9基因敲除小鼠在作为高血压的发病研究的模型鼠的用途。

本发明所述模型小鼠在高血压的发病研究中的应用。以及本发明所述方法在制备高血压发病研究的模型鼠中的应用。