[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其应用

说明书

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其应用。所述的纳米抗体命名为Nb12，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明将截短表达的Nsp2重组蛋白免疫骆驼后分离骆驼外周血淋巴细胞利用RT‑PCR扩增经过免疫的双峰驼VHH基因，将其连入pCANTAB 5E噬菌体载体，构建双峰驼重链抗体可变区文库，利用噬菌体展示技术经过3轮淘选，共筛选到44株Nsp2特异性纳米抗体，试验证明这些纳米抗体能够与Nsp2蛋白特异性反应，其中Nb12有较强的结合力。抗病毒试验结果表明在接毒量为0.01个MOI时，纳米抗体Nb12在PAM细胞和Marc‑145细胞上均显示出对病毒复制的抑制作用。因此，本发明的提出为后续PRRSV Nsp2的研究以及PRRSV的防控和诊断提供了新的技术手段。

技术领域

本发明涉及一种纳米抗体以及应用，特别涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其应用，本发明属于生物技术领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由 PRRS病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的病毒性传染病，该病在临床上主要引起母猪流产以及各年龄段猪的呼吸系统疾病，给养猪业造成不可挽回的经济损失。由于PRRSV具有高度变异性和抗体依赖的增强作用，现有的疫苗并不能给猪群提供完全的免疫保护，因此有必要尝试研究新型抗病毒策略。PRRSV的非结构蛋白2(Nonstructural protein 2，Nsp2)是PRRSV最大的非结构蛋白，它的顺式结构和反式结构都具有蛋白酶活性，对病毒的毒力至关重要，是研发抗PRRSV药物的理想靶标蛋白。

纳米抗体(Nanobody)具有分子量小、结构稳定、可溶性好、特异性强、生产成本低以及可以识别特殊抗原表位等优点。目前已有针对多种人类病毒纳米抗体的相关报道，研究结果显示其具有良好的临床应用前景，例如针对呼吸道合胞病毒的 ALX-0171，是第一个处于临床阶段的抗病毒纳米抗体药物。与之相反在动物病毒疾病中纳米抗体鲜见报道。

因此，本发明以Nsp2为靶标蛋白，选取保守性较强的蛋白酶段和B细胞表位段作为免疫原免疫骆驼，利用噬菌体展示技术筛选具有高亲和力的针对PRRSV Nsp2的特异性纳米抗体，并对其进行鉴定，为后续PRRSV Nsp2的研究以及PRRSV 的防控和诊断提供新的技术手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其在抗猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(Nsp2)的纳米抗体，本发明将截短表达的Nsp2重组蛋白免疫骆驼后分离骆驼外周血淋巴细胞利用RT-PCR 扩增经过免疫的双峰驼VHH基因，将其连入pCANTAB 5E噬菌体载体，构建双峰驼重链抗体可变区文库，利用噬菌体展示技术经过3轮淘选，共筛选到44株Nsp2 特异性纳米抗体，试验证明这些纳米抗体能够与Nsp2蛋白特异性反应，其中Nb11、 Nb12和Nb60与Nsp2有较强的结合力，被选用于下一步抗病毒试验的研究。我们分别在PAM细胞和Marc-145细胞开展了病毒感染实验，选取了本实验室分离的高致病性PRRSV HuN4株，试验表明在接毒量为1个MOI时纳米抗体没有显示出抗病毒效果，减小接毒量至0.01个MOI后，在PAM细胞和Marc-145细胞上均显示出对病毒复制的抑制作用。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2 蛋白纳米抗体，所述的纳米抗体命名为Nb12，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

编码所述纳米抗体的多核苷酸以及含有所述多核苷酸的表达载体也在本发明的保护范围之内。其中，优选的，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。