[发明专利]一种生产谷氨酸脱羧酶的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种生产谷氨酸脱羧酶的方法及其应用，属于生物技术领域。本发明成功以食品级枯草芽孢杆菌为宿主构建得到了可表达谷氨酸脱羧酶的重组枯草芽孢杆菌；利用此重组枯草芽孢杆菌可生产得到食品级谷氨酸脱羧酶以及食品级γ‑氨基丁酸，为谷氨酸脱羧酶和γ‑氨基丁酸在食品和医药领域的应用奠定了基础。本发明提供了一种生产食品级谷氨酸脱羧酶的方法，此方法为在以本发明的重组枯草芽孢杆菌为生产菌株生产食品级谷氨酸脱羧酶的过程中添加吡哆醛以提高食品级谷氨酸脱羧酶的产量；利用此方法摇瓶发酵48h，即可使细胞破碎上清液中谷氨酸脱羧酶的酶活高达28.14U/mL，是不添加吡哆醛的1.72倍。

技术领域

本发明涉及一种生产谷氨酸脱羧酶的方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)是一种四碳非蛋白氨基酸，是大多数原核生物和真核生物氨基酸库的重要组成部分。研究表明，GABA具有促进睡眠、增强记忆力，抗焦虑，预防和治疗癫痫，延缓脑衰老，舒缓血管，调节激素分泌、提高受精率，解除氨毒、增进肝功能等功效，因此，GABA被广泛应用于医药、食品、化工及农业等领域。

目前，γ-氨基丁酸的生产方法有化学合成法、植物富集法和生物合成法。其中，化学合成法主要是将邻苯二甲酰亚胺钾和γ-氯丁氰于180℃的高温条件下进行反应以生产得到GABA，但是，受到苛刻的反应条件及昂贵的天然原料的限制，利用化学合成法生产GABA成本高，并且，利用化学法生产得到的GABA安全性差，只能用于化工领域，不能达到食品和医药领域的要求。

植物富集法主要是利用从植物组织细胞内分离得到的谷氨酸脱羧酶(Glutamatedecarboxylase，简称GAD，EC 4.1.1.15)脱去L-谷氨酸的α-羧基以生产得到GABA，但是，谷氨酸脱羧酶在植物中的存在量很低，很难从植物组织中大量提取分离，因此，利用植物富集法生产GABA的可行性过低，无法满足市场需求。

生物合成法则主要是利用从微生物细胞内分离得到的谷氨酸脱羧酶或能够生产谷氨酸脱羧酶的微生物全细胞专一、不可逆地脱去L-谷氨酸的α-羧基以生产得到GABA，此方法的优点是反应条件温和、不需要昂贵的原料、能耗低，并且，微生物来源的谷氨酸脱羧酶和能够生产谷氨酸脱羧酶的微生物细胞可通过简单的细胞培养大量获取。

但是，由于目前的可生产谷氨酸脱羧酶的微生物菌株多为大肠杆菌等非食品安全菌株，例如，KANG等人对大肠杆菌来源的谷氨酸脱羧酶进行突变获得了GAD△466，GAD△466的催化活力和适宜pH范围均较野生型有所提升，但是，其用于表达GAD△466的大肠杆菌宿主在发酵过程中需要添加价格昂贵且有毒害作用的IPTG作为诱导剂诱导产酶，并且，其用于表达GAD△466的大肠杆菌宿主在发酵过程中易产生内毒素，因此，其生产得到的GAD△466安全性也不高，距离满足食品和医药领域的要求还有一定的距离(具体可见参考文献：KANG TJ，HO NAT，PACK SP.Buffer-free production ofgamma-aminobutyric acid usingan engineered glutamate decarboxylase from Escherichia coli[J].Enzyme and Mi-crobialTechnology，2013，53(3):200-205)。

因此，急需找到一种可生产食品级γ-氨基丁酸的方法以满足食品和医药领域对γ-氨基丁酸的需求。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种生产食品级γ-氨基丁酸的方法。

[技术方案]