[发明专利]一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本专利公开了一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用，其中，所述产黄青霉基因工程菌中Pc‑somA基因的序列被Bleo抗性基因替代；所述产黄青霉为ATCC48271；其构建方法为：(1)提取产黄青霉的基因组DNA；(2)构建基因敲除的片段；(3)制备产黄青霉的原生质体；(4)将基因敲除的片段导入制备的原生质体中进行同源重组，得到重组产黄青霉基因工程菌。有益效果：本发明所提供的基因工程菌使产黄青霉在固定化发酵产青霉素过程中生物膜量OD570增多了接近2倍，使菌丝可以和塑料介质更好的吸附结合，提高了青霉素的效价达到1963.25U/mL，同时缩短了整个发酵周期，缩短24h，减少生产成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

目前为止，青霉素因其具有良好的治疗效果和抗菌能力，仍然是我国临床上使用最多的抗生素之一。从1942年弗莱明发现青霉素到青霉素的提纯以及大批量生产，经历了很多年的努力，它的研制成功使人们对细菌的抵抗能力大大增强，带动抗生素家族的发展。青霉素类抗生物是一种β-内酰胺衍生物的总称，可以分为青霉素G、青霉素V、耐酶青霉素、氨苄西林等；青霉素也可分为天然青霉素和半合成青霉素。天然青霉素主要以发酵法为主，但是成本问题就是人们关注的重点。

以前发酵生产青霉素使用的是点青霉，随着人们后来的研究，绿孢子丝状真菌产黄青霉成为青霉素的主要生产菌。发酵法生产青霉素，是获得天然青霉素的主要生产途径。目前，细胞固定化的方法主要有：包埋法、吸附法、交联法等。对于丝状真菌的固定化细胞发酵，我们所采用的是吸附法，此方法只要在选择合适的吸附介质情况下，操作简单，而且菌株的形态也不会发生改变，只要形态合适更有利于在工业上的大量应用。吸附法主要是依靠一些比较弱的相互作用力比如静电作用力、疏水作用力等与细胞相互作用，从而使细胞吸附在介质表面生长，死细胞的脱落和活细胞的再吸附在这过程中达到一个平衡的动态过程，发酵效率较游离有所提高。

在固定化发酵过程中，人们发现微生物会产生，而且生物膜的多少对固定化发酵的性能产生较大的差异，因此，对生物膜成膜机制的研究，将有助于我们进一步了解生物膜形成的机制，让生物膜成为一种固定化的介质成为可能。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中产黄青霉发酵生产青霉素种子培养时间长，动能消耗多而成本高的问题，提供一株重组产黄青霉基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述重组产黄青霉基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述重组产黄青霉基因工程菌的应用。

发明思路：Pc-somA参与气生菌丝的分化，粘附的过程、产孢子相关基因的表达以及半乳糖氨基半乳糖(GAG)的合成。研究已证明粘附和GAG的合成都影响生物膜的形成。我们通过实验发现Pc-somA基因能够调控生物膜的生成，进而对固定化发酵产生一定的影响，所以固定化发酵青霉素也受到影响。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一株重组产黄青霉基因工程菌，其中，所述产黄青霉基因工程菌中Pc-somA基因的序列被Bleo抗性基因替代；其中，所述产黄青霉(Penicillium chrysogenum)为ATCC48271。

其中，所述Pc-somA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；Pc-somA基因的序列被bleo抗性基因替代后重组菌株ΔPc-somA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

上述重组产黄青霉基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取产黄青霉ATCC48271的基因组DNA；

(2)构建基因敲除的片段；

(3)制备产黄青霉的原生质体；