[发明专利]小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法

权利要求书

1.小反刍兽疫抗体和抗原胶体金检测方法，其特征在于，包括以下步骤；

步骤一：制备培养基和溶液：

步骤二：样品垫的制备：

步骤三：胶体金的制备：

步骤四：重组蛋白pGEX-4T-V、Nig 75/1浓缩病毒和抗V蛋白的三株单抗的金标记：

步骤五：滑膜的制备；

步骤六：PPR双抗体和双抗原夹心胶体金试纸条的组装、分切和包装

步骤七：PPR双抗体夹心胶体金试纸条样品的检测

步骤八：PPR双抗原夹心胶体金试纸条样品的检测

将步骤五滑膜包被的二种抗原pGEX-4T-V蛋白和浓缩的Nig 75/1病毒与金标的pGEX-4T-V蛋白和Nig 75/1浓缩病毒两两进行配对检测绵羊血清样品和单抗；

所述的步骤四包括；

(1)取5个EP管，吸取1mL步骤三得到的胶体金溶液润洗每个EP管1次，弃掉胶体金溶液；

(2)润洗的5个EP管里再加入1mL的胶体金溶液，加入0.1M的K₂CO₃ 10μL/管，迅速颠倒混匀；

(3)分别吸取2mg/mL纯化的重组蛋白pGEX-4T-V、浓缩的Nig75/1病毒和三株单抗5μL加入到EP管，放入到机器上150rpm旋转混匀30min；

(4)将步骤(3)的溶液混匀后，加入10μL/管10％BSA溶液，轻轻颠倒混匀，放入到机器上150rpm旋转终止10min；

(5)在4℃、10000rpm离心20min，可见管底有沉淀；

(6)用1mL枪头移除上清，避免悬起沉淀；

(7)每管加330μL金复溶液，轻轻混匀放置4℃备用；

所述的步骤五包括；

(1)PVC板上NC膜的粘贴：轻轻揭开PVC板上NC膜粘贴处的保护膜，将NC膜CN140从左向右均匀推进，使其牢固的粘贴在PVC板上；

(2)NC膜上质控线C线溶液配制：包被液将羊抗鼠和兔抗羊IgG抗体稀释至0.5mg/mL混匀，为C线的划线溶液，一块PVC板需要35μL溶液；

(3)NC膜上质控线T线溶液配制：分别吸取20μL纯化的重组蛋白pGEX-4T-V、浓缩的Nig75/1病毒和三株单抗加入到15μL包被液中混匀，为T线的划线溶液；

(4)NC膜上包被即滑膜：在NC膜的一端做好C线和T线的标记，C线和T线的间距为0.5cm，T线与NC膜下缘的距离为1cm，C线与NC膜上缘的距离为1cm，划线浓度均为1μL/cm，速度50mm/s；

(5)干燥：NC膜上滑膜完成后，将PVC板放置在45℃的烘箱中烘烤20-24h后，进行组装；

所述的步骤六为，步骤五完成后，在密闭的房间里，湿度≤30％，温度18-25℃进行试纸条的组装；

(1)撕去步骤五PVC板背衬上端2.5cm宽的隔离纸，黏贴上吸水纸，并使吸水纸下端与NC膜至少重叠2mm；

(2)撕去PVC板背衬下端所有的隔离纸，黏贴上样品垫，并使样品垫上端与NC膜至少重叠2mm；

(3)透明胶带轻轻密封NC膜与样品垫结合处；

(4)使用切割机切割成宽度为3mm左右的条状，放入铝箔袋中，加入干燥剂，密封常温放置备用；

所述的步骤七具体为，将步骤五滑膜包被的三株单抗4F2、4F11和Y3E6与步骤四金标记的单抗Y3E6、4F2和4F11两两进行配对检测Nig 75/1浓缩病毒，具体步骤如下：

(1)96孔板分别加入步骤四金标记的单抗Y3E6、4F2和4F11各20μL，Nig 75/1病毒20μL，金复溶液40μL，混匀备用；同时用羊的PPR阴性血清做对照；

(2)将步骤六的4F2、4F11和Y3E6胶体金试纸条分别插入到上述96孔中，室温反应5min后取出，眼观检测结果；

(3)标记的4F2、4F11和Y3E6三株单抗，分别与4F2、4F11和Y3E6单抗包被的膜两两交叉配对进行胶体金试纸条检测；

所述的步骤八具体步骤如下：

(1)步骤四金标记的pGEX-4T-V蛋白和浓缩的Nig 75/1病毒，分别与步骤六Nig 75/1病毒和pGEX-4T-V蛋白包被的膜交叉进行样品检测；

(2)96孔板中分别加入步骤四标记的pGEX-4T-V蛋白和Nig 75/1抗原各20μL，绵羊血清和三株单抗腹水分别20μL，金复溶液40μL，混匀备用；同时用羊和老鼠阴性血清做对照；

(3)将步骤六制备的Nig 75/1病毒和pGEX-4T-V蛋白胶体金试纸条分别插入到步骤(2)的96孔中，室温反应5min后取出，眼观检测结果；

该方法不用于疾病的诊断方法。