[发明专利]一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法

说明书

本发明提供一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法，用预先温热的完全培养基稀释电穿孔转染后的细胞获得细胞悬液，然后进行细胞孵育、分选接种，再经细胞培养获得单细胞克隆。本发明在电转原代细胞转移、培养过程中，使用预热的完全培养基，将电转细胞置于培养箱中孵育，有利于载体通过电转微孔进入细胞，再配合在利用流式细胞仪分选单细胞时先在96孔培养板中添加预热的完全培养基，减少细胞微环境变化与分选喷射对细胞的损伤，提高了细胞的存活与增殖率。

技术领域

本发明涉及细胞培养，具体涉及一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法，属于细胞工程技术领域。

背景技术

原代细胞是指利用胰蛋白酶或其他技术手段从活体动物或组织中分离、培养获得的细胞，因其生物性状尚未发生大的变化，仍保持原有细胞特性，在一定程度上能模拟体内状态，被广泛应用于蛋白质组学、基因组学、遗传学以及生物医药等领域。来源于同一组织的同一类型细胞，在形态特征上虽然十分相似，但其遗传物质、生理、生化却千差万别，因此构建遗传特性一致的稳定细胞系，在基因功能研究、基因表达调控、突变分析、蛋白生产以及转基因动物培育等领域中的应用越来越广泛。

构建稳定细胞系通常采用病毒侵染法和非病毒转染法。病毒侵染法是将携带外源目的片段的病毒，如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒，转导入细胞，通过抗性筛选细胞克隆，获得稳定细胞系。非病毒转染法根据转染途径的差异，可分为物理转染、化学转染和生物转染。电穿孔转染又称电转就属于物理转染，它利用高强度电脉冲击穿细胞膜，提高细胞通透性，实现外源分子进入细胞，是目前应用范围最广、频率最高的转染方法。

原代细胞在高强度脉冲电场的作用下，细胞膜受到损伤，一部分细胞发生可逆的膜构形变化，短期内细胞非常脆弱，但能通过自身的修复恢复活力与增殖能力；另一部分细胞膜发生不可逆的构形变化，细胞会老化、凋亡。目前转染细胞单克隆分离主要采用有限稀释法、显微操作法以及流式细胞分选，有限稀释法不能确保将单个细胞接种到孔中的，获得的克隆很大一部来源于多个细胞；显微操作法和流式细胞分选虽然能将单个细胞接种到孔内，但必需增强电转原代细胞修复，否则细胞无法存活与增殖。

发明内容

针对原代细胞电转后，细胞活力低，接种的单个细胞增殖困难，很难获得单细胞克隆等问题，本发明提供了一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法。

除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比，所述浓度为质量百分比浓度。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种基于原代细胞电转的单细胞克隆培养方法，其特征在于：用预先温热的完全培养基稀释电穿孔转染后的细胞获得细胞悬液，然后进行细胞孵育、分选接种，再经细胞培养获得单细胞克隆。

根据本发明的一个实施方案，上述预先温热的完全培养基温度为35-39℃。

根据本发明的一个实施方案，上述细胞孵育为将细胞悬液放置在二氧化碳培养箱中孵育，孵育条件为35-39℃，5％二氧化碳。进一步，上述细胞孵育时间为0.5-4h。

根据本发明的一个实施方案，上述分选接种为利用流式细胞仪，将细胞分选接种至含预先温热完全培养基的96孔培养板中。进一步，所述96孔培养板所含预先温热完全培养基体积为50-200ul/孔。更进一步，所述利用流式细胞仪分选接种细胞，细胞接种量为1个/孔。

根据本发明的一个实施方案，上述细胞培养条件为35-39℃，5％二氧化碳培养箱，培养时间为12-15天。

根据本发明的一个实施方案，上述方法中，在分选接种之后细胞培养过程中，还存在细胞生长记录步骤，所述细胞生长记录步骤为利用Cloneselect Imager记录细胞生长状况。进一步，所述利用Cloneselect Imager记录细胞生长状况为第1，3，5，7，9，11天细胞生长状况。