[发明专利]一种可视化的非细胞体外显色体系及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种可视化的非细胞体外显色体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)工程菌的制备：

利用Red重组法敲除大肠杆菌菌株中β-半乳糖苷酶基因，获得工程菌；

(2)工程菌裂解液的制备：

测定上述工程菌的生长曲线，制备工程菌裂解液；

(3)显色体系的配制：

配制显色体系，包括工程菌裂解液、能量供应体系、氨基酸混合液和其他蛋白质合成所需的底物混合液；所述能量供应体系含磷酸烯醇式丙酮酸。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述能量供应体系的浓度为20～28mM；所述氨基酸混合液的浓度为40～60mM。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌菌株为BL21(DE3)；所述工程菌裂解液为敲除β-半乳糖苷酶基因的BL21(DE3)裂解液，即BL21(DE3)ΔlacZ裂解液，浓度为20～30％。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸混合液为用亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺加入水配成的等摩尔浓度的混合液。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述其他蛋白质合成所需的底物混合液为醋酸镁、谷氨酸钾、醋酸铵、HEPES-KOH、tRNA、叶酸、二硫苏糖醇、腐胺、亚精胺、草酸、ATP、CTP、UTP、GTP、PEG8000、RNA酶抑制剂和氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述显色体系中还添加海藻糖或聚乙烯醇作为保护剂。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述海藻糖的浓度为0.2～0.6M，聚乙烯醇的浓度为5％～10％。

8.权利要求1～7任意一项所述方法制备的可视化的非细胞体外显色体系。

9.权利要求8所述的可视化的非细胞体外显色体系在病原微生物检测中的应用，其特征在于，设计针对病原微生物检测靶标的Toehold-Switch元件质粒，该质粒5’端部分含有与检测靶标特异结合序列，3’端含有β-半乳糖苷酶基因，将上述质粒和待检样品加入非细胞体外显色体系中，静置反应，通过显色情况来判定体系中检测目标的有无，当呈现黄色时，体系不存在相应检测靶标，当呈现紫色时，体系存在相应检测靶标。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述反应温度为30±5℃，静置时间为20～60min。