[发明专利]一种多探针检测MGMT基因启动子DMR2区域甲基化位点的试剂盒及方法

说明书

本发明提供了一种多探针检测MGMT基因启动子DMR2区域甲基化位点的试剂盒及方法。试剂盒包括：用于检测MGMT启动子DMR2区域的2对引物对和5条探针的混合物、数字PCR预混液、荧光素酶、ddH₂O和校准文件。本发明所述试剂盒及方法通过使用针对MGMT基因设计的简并引物对基因MGMT启动子DMR2区域进行扩增，并且通过使用多条探针同时检测MGMT基因启动子DMR2区域中全部16个CpG岛富集区域，并通过引入校准文件进行荧光信号的校准，避免了样本CpG岛富集区域甲基化状态不同造成的假阴性结果，大大提高了检测准确度以及检出率。

技术领域

本发明涉及一种多探针检测MGMT基因启动子DMR2区域甲基化位点的试剂盒及方法，属于生物医学核酸检测技术领域。

背景技术

脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，其恶性程度高，中位总生存期小于15个月，我国脑胶质瘤年发病率为5-8人/10万，5年病死率仅次于胰腺癌和肺癌。在脑胶质瘤患者中发现约30％患者缺失MGMT(O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶)蛋白，MGMT蛋白是一种DNA修复蛋白，普遍存在于人体细胞内，其编码基因位于染色体10q26.3，全长170kb，由5个外显子和4个内含子组成。MGMT蛋白的主要功能是通过不可逆地将烷化基团从O6-mG转移到MGMT蛋白145位的半胱氨酸残基上而保护细胞免受烷化剂的致突变、致癌和细胞毒作用的损伤。MGMT基因通常不会发生突变或删除，这种引起MGMT蛋白缺失的现象可能是由基因产生修饰变化而引起的，而基因的甲基化是这种基因表观遗传修饰的主要类型。甲基化常常发生于基因启动子区域的CpG岛，MGMT基因的启动子上的CpG岛主要有两个区域，分别为DMR1和DMR2，当DMR1区域发生甲基化时，DMR2区域通常也会发生甲基化。有研究表明DMR2区域中的几个甲基化位点对MGMT基因的转录起着至关重要的作用，因此DMR2区域被认为是MGMT基因启动子上甲基化分析的最佳靶点。早在2012年，《中国中枢神经系统胶质瘤诊断和治疗指南》就推荐检测患者的MGMT基因甲基化状态从而指导化疗药物的选择。2014年发布的《中国脑胶质瘤分子诊疗指南》中进一步明确指出：存在MGMT基因甲基化的胶质瘤患者对化疗、放疗更敏感，采用替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)治疗的效果更佳。因此，快速准确地检测胶质瘤患者是否在MGMT基因启动子DMR2区域存在甲基化的情况，对于制定合理的用药方案、提高药物疗效具有重要的指导意义。目前，MGMT基因启动子DMR2区域甲基化位点的检测技术主要有四种方法：1、基因芯片法；2、测序法，基于测序的甲基化检测方法有直接焦磷酸测序法、亚硫酸氢盐基因测序法(bisulfitesequencingPCR，BSP)和二代测序法；3、甲基化敏感的限制性内切酶(Methylation-Sensitive restriction Endonuclease，MS-RE)法；4、甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR，MSP)法；5、荧光探针法。其中，基因芯片法和测序法通常检测过程繁琐，周期长，结果解读困难、价格昂贵；MS-RE方法产生的假阳性高且内切酶种类有限；MSP法是检测基因甲基化状态的经典方法，此方法仅需使用引物对目的片段进行扩增，在引物设计时需要两个已知的、包含多个完全甲基化或非甲基化CpG位点的区域，但是MGMT基因启动子DMR2区域具有上述特点的CpG位点并不多，因此限制了MSP的使用；荧光探针法是依托于荧光定量PCR或数字PCR平台，联合Taqman荧光探针对样本进行检测，从而提高了检测灵敏度和特异性。目前已知的采用荧光探针法检测甲基化位点的方法可以分为两类，第一类方法为MSP引物结合通用探针或甲基化特异性探针进行检测。例如，CN102424857A文件中公布了采用甲基化引物P1/P2结合Taqman通用探针定量检测甲基化DNA模板，非甲基化引物P3/P4结合Taqman通用探针定量检测非甲基化DNA模板，其中两对引物的正反向引物分别覆盖5个和4个CpG岛。该方法最多实现对位于引物区和探针区的3个CpG岛富集区域的检测，此类检测方法主要是通过引物设计识别甲基化，只有在正向和反向引物覆盖区域均存在甲基化状态，引物才得以结合并进行PCR扩增得到，因此该方法对于甲基化阳性的判定通常依赖于检测区域内全部位点均发生甲基化才可检出，而对于部分区域出现甲基化的样本则会出现漏检的结果；第二类方法为结合通用引物和甲基化特异性探针进行检测。例如，CN105463096A文件中针对MGMT基因启动子甲基化检测区域上、下游约200bp范围内设计通用正向引物a和反向引物b，针对MGMT基因启动子甲基化检测区域设计甲基化特异性检测探针c，其中探针覆盖5个CpG岛，此方法主要通过特异性探针识别甲基化位点，因此偏重于对一个CpG岛富集区域的检测，即由一条甲基化特异性探针所覆盖的CpG岛甲基化状态判断样本甲基化阴阳性，因为探针设计长度限制，该区域只能覆盖有限个数的CpG岛，而对于相距较远的CpG岛状态却无法进行检测。然而，从对大量甲基化位点的测序结果中我们首次发现，被判定为甲基化阳性的样本中各个CpG岛甲基化水平并不一致，出现了某些CpG岛富集区域为甲基化阴性的结果，因此对于MGMT基因启动子DMR2区域甲基化位点状态的判定一定要检测全部可能发生甲基化的位点，上述所述涉及到的荧光探针法不论是采用方法一还是方法二对MGMT基因启动子DMR2区域的甲基化检测，常常因为检测区域不完整而导致大量假阴性结果的发生。如果使用不同甲基化位点的多种探针混合进行同时检测则可以消除这种不良结果的发生。