[发明专利]一种特定代谢通路中代谢物的仪器检测方法

权利要求书

1.一种特定代谢通路中代谢物的仪器检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

a)代谢物的检索分类：检索KEGG数据库，按照不同的代谢通路，检索代谢物，按照代谢物的CAS号，检索METLIN数据库，在数据库中确定该代谢物的精确质量数，离子化方式，碰撞能及母离子和子离子参数；

b)细胞代谢物的提取：将细胞加入甲醇溶液中，于冰水中超声、涡旋；加入甲基叔丁基醚冰水中超声、涡旋，然后加入超纯水、离心，分别取上层和下层提取物备用；

c)UPLC-Q/TOF的定性分析：将步骤b)得到的上层和下层提取物分别进行UPLC-Q/TOF直接进样分析，寻找符合代谢物特征的化合物，当精确质量数、子离子、母离子、碰撞能及离子丰度比都符合，就可以确定此化合物即为所寻找的代谢物；

d)UPLC-QQQ的定量分析：将步骤c)寻找到的代谢物的特征信息编辑到UPLC-QQQ的方法文件中，采用UPLC-QQQ的MRM模式检测，对代谢物进行定量分析；

e)全代谢网络的代谢组检测平台构建：选择多条代谢通路，数据库查找及其仪器识别相关联获得代谢物信息，按照步骤b)所述方法提取细胞代谢产物，分别对上层提取物和下层提取物进行定性、定量检测，以对全代谢网络的代谢物进行检测。

2.根据权利要求1所述的特定代谢通路中代谢物的仪器检测方法，其特征在于：步骤a)中的代谢通路是KEGG数据库中包含的所有代谢通路。

3.根据权利要求2所述的特定代谢通路中代谢物的仪器检测方法，其特征在于：所述KEGG数据库中包含的所有代谢通路包括动物代谢通路和植物代谢通路。

4.根据权利要求1所述的特定代谢通路中代谢物的仪器检测方法，其特征在于：步骤c)中采用UPLC-Q/TOF直接进样分析，进样的细胞浓度是10⁶个/mL提取液；步骤c)中直接进样的分析过程中，四级杆质谱筛选目标离子，飞行时间质谱鉴定精确质量数。

5.根据权利要求1所述的特定代谢通路中代谢物的仪器检测方法，其特征在于：步骤d)中UPLC-QQQ的方法文件在一个模式中可以编辑300个化合物；步骤d)中将代谢物的特征信息编辑到UPLC-QQQ的方法文件的方法为：首先编辑不包含保留时间的方法文件，此文件每次放入50个代谢物，此方法用于确认每个化合物的保留时间，每个化合物的时间确认后再次编辑包括保留时间的方法文件，即可进行后续检测；步骤d)中检测结果出现的非单一峰化合物，需要结合化合物的性质定位目标峰。

6.根据权利要求1所述的特定代谢通路中代谢物的仪器检测方法，其特征在于：步骤a)中METLIN数据库中的质谱图不具有唯一性，需筛选干扰最小，响应最大的质谱图。

7.根据权利要求1所述的特定代谢通路中代谢物的仪器检测方法，其特征在于：步骤b)中甲醇溶液的浓度为75％，冰水中超声1min，涡旋1min；加入甲基叔丁基醚的量为300μL，冰水中超声1min，涡旋1min，加入超纯水的量为75μL，离心转速为20000r/min。

8.根据权利要求1所述的特定代谢通路中代谢物的仪器检测方法，其特征在于：步骤c)的UPLC-Q/TOF条件为：电喷雾离子源ESI温度为550℃，喷雾电压为5500V，碰撞能0V，15V，30V，45V。

9.根据权利要求1所述的特定代谢通路中代谢物的仪器检测方法，其特征在于：步骤d)的UPLC-QQQ的正离子模式质谱参数为：电喷雾离子源ESI温度为550℃，喷雾电压为5500V，气帘气压力为0.241MPa，Gas1压力为0.276MPa，Gas2压力为0.276MPa；负离子模式质谱参数为：电喷雾离子源ESI温度为550℃，喷雾电压为4500V，气帘气压力为0.241MPa，Gas1压力为0.276MPa，Gas2压力为0.276MPa。

10.根据权利要求1所述的特定代谢通路中代谢物的仪器检测方法，其特征在于：步骤d)的UPLC-QQQ中的色谱条件为：

正离子模式：色谱柱用ACQUITY UPLC BEH C8，2.1mm×100mm，1.7μm，柱温为50℃，进样量为10μL；流动相A为含甲酸0.1％(v/v)的超纯水，B相为含甲酸0.1％(v/v)的乙腈；流动相梯度为0-3min,90％,350μL/min,3-15min,100％,350μL/min,15-20min,100％,350μL/min，20-21min,100％,350μL/min,21-23min，90％,350μL/min；

负离子模式：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3，2.1mm×100mm，1.8μm，柱温为50℃，进样量为10μL；流动相A为5mM NH₄HCO₃的水，B为含5mM NH₄HCO₃的甲醇；流动相梯度为0-1min,2％,350μL/min,1-3min,2％,350μL/min,3-12min,42％,350μL/min，12-16min,100％,350μL/min,16-17min，2％,350μL/min,17-20min，2％,350μL/min。