[发明专利]一种AMA合成酶及其在合成AMA或其衍生物中的应用

说明书

本发明提供了一种AMA合成酶及其在合成AMA或其衍生物中的应用，属于基因工程技术领域。本发明所述的AMA合成酶基因序列如SEQ ID No.2所示，其编码蛋白序列如SEQ ID No.1所示。本发明发现来源于真菌的AMA合成酶能够低成本且高效地将O‑乙酰丝氨酸或O‑磷酸丝氨酸作为底物与天然氨基酸反应，生成Toxin A或其衍生物以及进一步催化Toxin A或其衍生物生成AMA和/或AMA衍生物中的任一种。本发明提供的AMA合成酶在抗生素佐剂制备领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种来源于米曲霉的AMA合成酶及其在合成AMA或其衍生物中的应用。

背景技术

AMA是一种能由米曲霉、黄曲霉、杂色曲霉等多种丝状真菌分泌的植物毒素。最早在1958年，AMA被发现能够敖合Fe²⁺而使马铃薯、柳树、大麦等患萎蔫病，进而引起植物凋零。

二十世纪七十年代，人们发现AMA是一种良好的金属螯合剂，能够抑制包括能够血管紧张素转化酶、氨肽酶、羧肽酶在内的多种金属蛋白酶的活性，并且具有较低的体内毒性(LD50＝250mg/kg)。

2014年，Wright和其合作者报道了在从环境微生物获得的溶于DMSO的大量天然产物提取物中对NDM-1的天然抑制剂所做的一个筛选，其中的一种提取物(来自A.versicolor)表现出特别强的抗NDM-1活性，被识别出是aspergillomarasmine A(AMA)。发现AMA能够鳌合NDM-I活性中心的Zn²⁺,可与美罗培南联合用药从而恢复多药耐药革兰氏阴性菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性。AMA在体外和体内都能完全恢复针对拥有VIM-型或NDM-型抗性基因的细菌病原体的抗菌功效，AMA是无毒且能被很好耐受的。

耐药菌的出现以及快速蔓延趋势给全世界人民的身体健康都带来了极大的威胁。所以人们对新型抗生素的需求，对解决细菌耐药性的需求也变得越来越迫切。这不仅是为了保证人类能够继续治愈感染性疾病，同时也是为了确保器官移植、化疗、手术等医疗操作手段得以继续安全实施的前提条件，因为这些医疗手段都会增加患者被细菌感染的风险和几率。因此，AMA在降低细菌耐药性方面的独特功能，使得AMA有望成为一种抗生素佐剂应用于临床医学领域，造福人类。

然而现阶段AMA的制备主要通过化学合成的方法来实现，操作步骤繁琐、反应条件剧烈、分离纯化困难，且无法实现克级以上的生产，给临床前研究带来了巨大的挑战。例如2016年，Wright课题组和本申请的申请人分别用aziridine opening(7步，3.8％)和Latestage oxidation(11步，收率为7.3％)完成了AMA的首次全合成及立体构型修正。之后Wright课题组和申请人分别用sulfamidate strategy(5步骤，收率为19％)和Mitsunobureaction(6步骤，收率为28％)对AMA的全合成路线进行了优化。即便如此，化学合成需要严苛的反应条件，繁琐的操作步骤，以及表现出的环境不友好性，难以在短时间内获得大量的天然产物，无法满足产业化需求。目前除了从培养基中分离以及化学合成的方法，没有其他获得AMA的手段，大大限制了其临床应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、合成AMA的节能环保方法，以克服现有技术的不足。本发明首先提供一种效果优良的AMA合成酶，利用该AMA合成酶可以低成本、高效率合成AMA及其衍生物。

第一方面，本发明提供了一种新的AMA合成酶，其来源于米曲霉(Aspergillusoryzae)具有：

1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸的序列与SEQ ID No.1同源性为80％、85％、90％、95％、98％、99％，且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。