[发明专利]一种SRDA等温核酸扩增试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了一种SRDA等温核酸扩增试剂盒及其应用，所述试剂盒包括蛋白组合物，所述蛋白组合物包括recA重组酶、Ago蛋白、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶，所述试剂盒还包括逆转录酶，通过加入Ago蛋白，显著提高了等温扩增效率，通过加入逆转录酶，实现了对DNA和RNA的通用检测，本发明的试剂盒检测特异性好，灵敏度高，扩增DNA的灵敏度达50copies/μL，扩增RNA的灵敏度达100copies/μL，具有极高的理论价值和临床应用价值。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种SRDA等温核酸扩增试剂盒及其应用。

背景技术

目前，常用的核酸检测方法主要包括经典PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片和等温核酸扩增技术等。其中，经典PCR作为核酸检测的金标准，应用范围最广、使用时间最长，是各种新兴的核酸检测方法的基础，但是存在特异性不足和易污染等问题；实时荧光定量PCR是在经典PCR的基础上发展起来的能够实时监测PCR进程的核酸扩增方法，特异性和灵敏度均优于经典PCR，近年来已经成为核酸诊断行业应用最广泛的一种核酸定量技术，但是该方法的扩增时间较长，一般需要约1.5h，而且需要配合价格昂贵的检测设备，不利于其在经济欠发达地区或非实验室条件下的应用。

随着核酸检测技术的进一步发展，等温核酸扩增技术得到了研究人员的广泛关注，逐渐发展出了包括环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、实时荧光等温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，SAT)和重组酶聚合酶等温扩增技术((Recombinase Polymerase Amplification，RPA)在内的多种等温核酸扩增技术。其中，LAMP和SAT虽然不再依赖于昂贵的检测仪器，但是操作较复杂，扩增时间仍然需要大约1小时；RPA作为公认的检测时间最短、操作最便捷的等温核酸扩增技术，不依赖于笨重和昂贵的荧光定量检测设备，反应时间只需5～20min，已成为国内外研究的热点。

RPA技术最先由英国Twist DX公司推出，目前市面上销售的产品主要以英国TwistDX公司的RPA等温核酸检测试剂盒和中国杭州众测生物技术有限公司生产的RAA等温核酸扩增检测试剂盒为主，但是，他们的试剂盒在进行DNA和RNA检测时需要采用2套不同的体系，同时，对于RNA的扩增灵敏度较低，只能达到约1000copies/μL。

CN 105525040 A公开了快速检测猪2型圆环病毒的实时荧光RPA试剂盒、试纸条RPA试剂盒及其用途，该两种试剂盒分别包括SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示的引物及各自的探针，虽然针对同一靶标序列，但引物和探针的修饰碱基和检测平台不同，实验证明本发明的两个试剂盒的敏感性均为10²拷贝/反应，并均只能特异性检测猪2型圆环病毒，检测结果与qPCR的符合度均为100％，所述的两个试剂盒均能快捷、高效、灵敏的检测猪2型圆环病毒，为猪2型圆环病毒的鉴别诊断提供了有效技术手段，但是所述试剂盒采用试纸条的方法，通过条带的亮度进行结果判定，这样对于结果的判定容易因实验人员主观原因导致误判。

CN 107828913 A公开了对虾白斑综合症(WSSV)的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒，检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、重组聚合酶和对照品；所述试剂盒特异性强，检测灵敏度高，可达到0.1fg/μL，准确度高、可靠，操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景，但是所述试剂盒同样不能用于RNA检测。

因此，为进一步提高RPA的检测灵敏性，同时实现采用一套体系检测DNA和RNA的目的，有必要开发新的RPA检测试剂盒，在核酸诊断领域具有重要意义。

发明内容