[发明专利]一种重组兔单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明公开了一种重组兔单克隆抗体的制备方法，利用免疫提升的兔B细胞进行分离、噬菌体展示等技术，通过特异性引物扩增出抗体基因片段，构建抗体库，使用抗原进行淘选，获得阳性克隆，测序鉴定，获得重链与轻链序列，进行体外重组表达，并测定抗体，本发明制备的单克隆抗体与传统方法制备单克隆抗体的制备相比，单克隆抗体制备效率更高，操作更便捷，实验兔的免疫系统筛选到的可以识别特定抗原的单克隆抗体，与小鼠单克隆抗体相比，兔单克隆抗体具有亲和力高、识别的抗原表位更丰富和能识别在小鼠体内没有免疫原性抗原的突出特点。

技术领域

本发明属于单克隆抗体制备领域，具体涉及一种重组兔单克隆抗体的制备方法。

背景技术

抗体是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质，它是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，抗体在疾病的诊断、免疫防治及基础研究中发挥作重要作用，抗体分为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体在医药治疗上有广泛的前景，被用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病；

中国发明专利CN1763217A公开了一种单克隆抗体的制备方法及其应用，该发明用杀菌后的金色葡萄球菌免疫BALB/c小鼠，再提取免疫鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗金色葡萄菌单克隆抗体的杂交瘤株，得到所需单克隆抗体，该发明通过杂交瘤细胞进一步进行获得单克隆抗体的制备效率较低高，产量不高，同时通过小鼠免疫系筛选的单克隆抗体单抗亲和力整体较低，识别的抗原表位较为单一，不能识别没有免疫原性的抗原。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组兔单克隆抗体的制备方法，利用免疫提升的兔B细胞进行分离、噬菌体展示等技术，通过特异性引物扩增出抗体基因片段，构建抗体库，使用抗原进行淘选，获得阳性克隆，测序鉴定，获得重链与轻链序列，进行体外重组表达，并测定抗体，本发明制备的单克隆抗体与传统方法制备单克隆抗体的制备相比单克隆抗体制备效率更高，操作便捷，同时用实验兔的免疫系统筛选到的可以识别特定抗原的单克隆抗体，与小鼠单克隆抗体相比，兔单克隆抗体具有亲和力高、识别的抗原表位更丰富和能识别在小鼠体内没有免疫原性的抗原。

本发明要解决的技术问题：

1、传统制备单克隆抗体，大多采用小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞，进行融合培养杂交瘤细胞，进一步获得单克隆抗体，但得到的单克隆抗体的单抗亲和力整体较低，识别的抗原表位较为单一，不能识别没有免疫原性的抗原。

2、传统制备单克隆抗体的方法为通过免疫增强的小鼠的B细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合得到杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞进行抗体检测后，进行克隆化，得到阳性杂交瘤细胞，将阳性杂交瘤细胞注射到小鼠的腹腔中，培养一周提取腹水中的单克隆抗体，该方法获得的单克隆抗体有被动物病毒污染的可能，同时单克隆抗体制备效率低，操作复杂。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种重组兔单克隆抗体的制备方法，包括以下方法：

(1)、将兔背部部分毛发剪下，用酒精擦拭兔的背部，将重组蛋白和弗氏完全佐剂加入烧杯中，搅拌至充分乳化，注射至兔背部皮下进行培养，得到免疫增强的兔；

(2)、提取步骤(1)获得的免疫增强的兔的B细胞，通过兔的B细胞进一步获得混合抗体基因片段；

(3)、将步骤(2)获得的混合抗体基因片段进行扩增，通过扩增后的混合抗体基因片段建立噬菌体抗体文库，进一步对噬菌体文库进行包装；

(4)、将目的抗原包被于固相表面加入步骤(3)形成的噬菌体抗体文库，得到目的抗体，进行检测获得抗体序列；

(5)、步骤(4)得到的抗体序列进行分析，构建表达载体并进行鉴定。