[发明专利]国兰原生质体瞬时表达系统及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种国兰原生质体瞬时表达系统的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）采集国兰的花瓣或者叶片，切成细丝，放入酶解液中酶解2~6h，得到原生质体；

（2）将等量的W5溶液加入步骤（1）所述的酶解液中，过滤，离心，弃上清，加入W5溶液，0~4℃静置30 min，弃上清，用MMG溶液重悬沉降的原生质体，得到纯化的原生质体；

（3）将步骤（2）中纯化的原生质体采用MMG溶液调整浓度，与预冷的含有目的基因的重组质粒混匀，加入PEG-CaCl₂溶液处理5~20min，加入W5溶液终止反应；

（4）100 g离心3 min，弃上清，加入1 mL的WI溶液，22~24℃避光孵育12~24 h，得到国兰原生质体瞬时表达系统；

步骤（1）中所述的国兰为墨兰；

步骤（1）中所述的花瓣为初花期的幼嫩花瓣；所述的叶片为叶芽基部的幼嫩叶肉；

步骤（1）中所述的酶解液通过如下步骤制备得到：将浓度为质量体积比1.2%的纤维素酶R-10、浓度为质量体积比0.6%的离析酶R-10、浓度为0.4或0.5 mol/L的甘露醇、浓度为20mmol/L的氯化钾以及pH=5.7、浓度为20 mmol/L的MES缓冲液混匀，55℃水浴10 min，冷却至室温，加入浓度为10 mmol/L的氯化钙、浓度为质量体积比0.1的牛血清蛋白和浓度为5mmol/L 的 β-巯基乙醇，用0.45 μm滤膜过滤除菌；其中；原生质体来自国兰的花瓣时，甘露醇的浓度为0.5 mol/L；原生质体来自国兰的叶片时，浓度为0.4 mol/L；

步骤（2）中所述的W5溶液通过如下步骤制备得到：浓度为154 mmol/L的氯化钠，浓度为125 mmol/L的氯化钙，浓度为5 mmol/L的氯化钾和pH=5.7、浓度为20 mmol/L的MES缓冲液混匀，调节pH至5.7~5.8；

步骤（2）和（3）中所述的MMG溶液通过如下步骤制备得到：浓度为0.4 mol/L的甘露醇，浓度为15 mmol/L的氯化镁，pH=5.7、浓度为4 mmol/L的MES缓冲液混匀，调节pH至5.7~5.8；

步骤（3）中，

原生质体来自国兰的花瓣时，含有目的基因的重组质粒为含有花器官特征决定相关基因CsAP3和CsPI完整编码序列的重组质粒pAN580-CsAP3和pAN580-CsPI；

原生质体来自国兰的叶片时，含有目的基因的重组质粒为含有CsAP3与黄色荧光蛋白N端融合蛋白的重组质粒pSPYNE-CsAP3以及含有CsPI与黄色荧光蛋白C端融合蛋白的重组质粒pSPYNE-CsPI；

步骤（3）中所述的PEG-CaCl₂溶液的配方为：质量体积比为25%的PEG4000、0.2 mol/L甘露醇和0.1 mol/L氯化钙；

步骤（3）中所述的加入PEG-CaCl₂溶液处理为避光静置处理；处理时间为15 min；

步骤（3）中所述的含有目的基因的重组质粒在体系中的浓度为20 μg/20 mL；

步骤（4）中所述的WI溶液的配方为：0.5 mol/L甘露醇，20 mmol/L氯化钾和pH=5.7、4mmol/L MES缓冲液。

2.根据权利要求1所述的国兰原生质体瞬时表达系统的构建方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的酶解为避光条件下，28℃酶解6 h。

3.根据权利要求1所述的国兰原生质体瞬时表达系统的构建方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的国兰为墨兰品种白墨。