[发明专利]一种产脲酶抑制剂的菌株筛选方法及减少粪便氨排放的方法

权利要求书

1.一种产脲酶抑制剂菌株的筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤a、将畜禽粪便制成菌悬液，用NA培养基常规培养，将培养所得菌落接种于含有尿素和酸碱指示剂的平板初筛培养基中培养；

步骤b、从步骤a培养所得菌落中挑取周围未变色的菌落，筛选不产脲酶的菌株制成待选样品发酵液；

步骤c、从步骤a培养所得菌落中挑取周围变色的菌落，制成产脲酶菌株发酵液；

步骤d、用步骤c所得产脲酶菌株发酵液从步骤b所得各所述待选样品发酵液中筛选出产脲酶抑制剂的菌株。

2.根据权利要求1所述的产脲酶抑制剂菌株的筛选方法，其特征在于：步骤a中所述平板初筛培养基中含有20mg/ml尿素、1mg/ml酚红、10mg/ml蔗糖、10mg/ml蛋白胨、3mg/ml牛肉粉、5mg/ml氯化钠和20mg/ml琼脂，余量为蒸馏水，pH为6.4。

3.根据权利要求1所述的产脲酶抑制剂菌株的筛选方法，其特征在于：步骤a所述畜禽粪便为新鲜畜禽粪便在常温放置24～36h的粪便。

4.根据权利要求1所述的产脲酶抑制剂菌株的筛选方法，其特征在于：步骤b中所述筛选不产脲酶的菌株制成待选样品发酵液的方法为：将所述周围未变色的菌落分别用NA培养基培养24～48h，然后接种于含有尿素的摇瓶初筛培养基中摇床培养1～2天，不浑浊的样品即为待选样品发酵液。

5.根据权利要求4所述的产脲酶抑制剂菌株的筛选方法，其特征在于，所述摇瓶初筛培养基中含有20mg/ml尿素、10mg/ml蔗糖、5mg/ml氯化钾、0.5mg/ml硫酸镁、0.5mg/ml氯化钙、1mg/ml磷酸二氢钠和1mg/ml磷酸氢二钠，余量为蒸馏水，pH为6～8。

6.根据权利要求1所述的产脲酶抑制剂菌株的筛选方法，其特征在于，步骤c中制备产脲酶菌株发酵液的方法为：从步骤a培养所得菌落中挑取周围变成红色的菌落，分别用NA培养基培养24～48h，然后接种于NB培养基中摇床培养24～48h，得到各菌株发酵液；向所得各菌株发酵液中分别加入尿素水溶液和酚红指示剂，摇匀，取粉红色出现时间最短的发酵液，即为产脲酶菌株发酵液。

7.根据权利要求1所述的产脲酶抑制剂菌株的筛选方法，其特征在于，步骤c还包括对所得产脲酶菌株发酵液进行复筛，所述复筛的方法为：将所述产脲酶菌株发酵液与尿素缓冲液混合，通过所述尿素缓冲液中的尿素消耗情况判断所述产脲酶菌株发酵液菌株的活性。

8.根据权利要求7所述的产脲酶抑制剂菌株的筛选方法，其特征在于，所述复筛的具体操作为：取200μl所述产脲酶菌株发酵液，加入10ml尿素缓冲液，充分振摇混合后立即置于30℃±0.5℃恒温水浴中保持30min±10s，加入10ml盐酸溶液，振摇后迅速冷却至20℃以下，用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈蓝绿色；另取200μl经灭活的所述产脲酶菌株发酵液，加入10ml盐酸溶液振摇，再加入10ml尿素缓冲液振摇，充分振摇后立即置于30℃±0.5℃恒温水浴中保持30min±10s，迅速冷却至20℃以下，用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈蓝绿色；根据两份所述产脲酶菌株发酵液消耗的氢氧化钠标准溶液体积判断所述产脲酶菌株发酵液的活性；其中所述尿素缓冲液为含有0.5mol/L尿素、pH为7.0±0.1的磷酸盐缓冲液，所述盐酸溶液中氯化氢的浓度为0.1mol/L。

9.根据权利要求1所述的产脲酶抑制剂菌株的筛选方法，其特征在于，步骤d的具体操作方法为：将步骤b所得各所述待选样品发酵液分别与所述产脲酶菌株发酵液混合，加入尿素和酚红指示剂，稀释后摇匀，作为试验品；同法制备不含待选样品发酵液的样品，作为阳性对照；对比各所述试验品与所述阳性对照的颜色变为粉红色的时间，变色时间长于所述阳性对照至少0.5min的所述试验品对应的菌株，即为产脲酶抑制剂的菌株。

10.一种减少粪便氨排放的方法，其特征在于，用权利要求1～9任一项所述的产脲酶抑制剂菌株的筛选方法得到的菌株制成微生物菌剂用于饲料添加剂或粪便堆肥菌剂。