[发明专利]去泛素化酶活性探针及其制备和应用

说明书

本发明提供了一种去泛素化酶活性探针及其制备和应用。具体地，本发明提供了如式Ia或式Ib所示的探针，FL‑Wa‑L1‑(Arg‑Leu‑Arg‑Gly‑Gly)‑L2‑Wb‑FQ(Ia)，FQ‑Wa‑L1‑(Arg‑Leu‑Arg‑Gly‑Gly)‑L2‑Wb‑FL(Ib)。本发明的探针能够表征多种去泛素化酶的活性并用于去泛素化酶抑制剂的高通量筛选。

技术领域

本发明属于探针领域，具体涉及一种去泛素化酶活性探针及其制备和应用。

背景技术

蛋白质的泛素化过程在调节许多细胞功能(例如蛋白质降解，DNA修复和细胞信号转导)中起着关键作用。这些过程的失调会导致诸如炎症性疾病，神经退行性疾病或癌症等病理状况，因此严格调控泛素系统至关重要。E3泛素连接酶的泛素化作用可以通过去泛素化酶(DUBs)的活性来抵消。人类细胞含有约100个DUB，它们分属六个家族，其中五个家族，即卵巢肿瘤蛋白酶(OTU)，泛素特异性蛋白酶(USPs)，泛素C末端水解酶(UCH)，约瑟芬域蛋白酶(MJD家族)以及含MIU结构域的新型DUB家族蛋白酶(MINDY)属于半胱氨酸蛋白酶，而JAB1/MPN/Mov34金属酶结构域家族成员则是锌依赖性金属蛋白酶。不同的去泛素化酶具有不同的底物特异性和泛素链特异性。特定去泛素化酶中的突变与神经退行性疾病，慢性炎症，自身免疫，传染病和癌症有关。

相较于泛素蛋白酶体系，去泛素化酶的研究方兴未艾。目前，已有报道指出USP4，USP6，USP8，USP14，USP28和UCHL5在癌症的发展进程中占据主导作用。特别的，USP14被认为与卵巢癌和结肠癌有紧密关系。对不同卵巢癌细胞进行基因筛查发现存在USP14的异常，同时另一项研究发现结肠癌病人中的USP14的高表达与病理阶段和淋巴结的转移呈正相关。因此抑制能稳定癌蛋白(oncoprotein)的DUBs以及激活充当肿瘤抑制物(tumorsuppressor)的DUBs可能是一种有前途的治疗策略。比如，通过敲低USP8可以降低细胞内EGFR酪氨酸激酶的活性，从而抑制吉非替尼耐药的非小细胞肺癌的增殖；而在MM细胞中USP14和UCHL5都存在高表达，这两个去泛素化酶都与蛋白酶体的19s调节亚基可逆结合，通过siRNA敲低它们会使得MM的细胞增殖受到影响。这些发现促使了各种去泛素化酶抑制剂的研究。S.Linder课题组于2011年报道了一个USP14/UCHL5双重抑制剂b-AP15。b-AP15能高效地抑制多发性骨髓瘤细胞株中的USP14，以及泛素链的剪切，进而抑制肿瘤细胞生长，因此，其类似物VLX1570已进入到临床研究当中。而USP7作为稳定癌症治疗靶蛋白MDM2的去泛素化酶，也吸引了多家药企研制其抑制剂，并已有数个特异性抑制剂处于临床前验证阶段。另一类特殊的泛素链——线性泛素链(M1)被认为在NF-kB细胞通路中发挥着重要作用。与线性泛素链相关的去泛素化酶已知的有CYLD，A20和OTULIN，他们都可以负调控NF-kB通路，从而抑制炎症反应的发生。

当前，去泛素化酶活性的表征，以及去泛素化酶抑制剂的体外活性测试主要基于两种人工合成修饰的去泛素酶底物——基于单个泛素分子设计的Ub-AMC和Ub-Rho110。许多已报道的去泛素化酶抑制剂，如USP14的抑制剂IU1、USP8的抑制剂HY50737都是基于Ub-AMC水解试验筛选得到。但是由于这类探针某些去泛素化酶不能对其水解，使得其适用范围受到限制；同时，这类化学合成的生物大分子探针成本高昂，例如，需要对预先表达纯化的泛素蛋白进行人工修饰，该修饰步骤合成效率低下，在完成修饰后还需要再次进行蛋白纯化，并且还需要进行蛋白质复性步骤后才能使用，对运输与保存都有特殊要求(需要低温保存)，也限制其在药物发现中的有效应用。现有技术中也有基于双泛素分子，三泛素分子，四泛素分子的分子内荧光淬灭对探针，期望改善探针的灵敏度，但是这类探针分子的生产成本更高，而普适性更低。

综上所述，本领域迫切需要开发一类新的普适性更好、灵敏度高、易合成、成本更低的新型去泛素化酶探针(或底物)。

发明内容

本发明的目的就是提供一类新的普适性更好、灵敏度高、易合成、成本更低的新型去泛素化酶探针(或底物)。