[发明专利]一种同时检测副猪嗜血杆菌、猪细小病毒、猪圆环病毒2型的三重实时荧光PCR方法

说明书

本发明公开了一种利用特异性引物同时检测副猪嗜血杆菌（HPS）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）的三重实时荧光PCR方法，其包括步骤：（1）分别合成HPS、PPV、PCV2所对应的特异性引物；（2）提取猪组织研磨样品的DNA；（3）将步骤（1）所述的所有特异性引物置于三重荧光PCR反应体系中，以步骤（2）所述的DNA为模板，进行PCR扩增；根据熔解曲线来分析猪是否感染HPS、PPV、PCV2中的至少一种。本发明为多重荧光PCR的研究提供了便利，适用范围较广，同时具有广泛的科研价值和应用前景。

技术领域

本发明属于猪病原检测技术领域，具体涉及一种同时检测猪体内细菌和病毒感染(HPS、PPV和PCV2)的三重实时荧光PCR方法。

背景技术

随着养殖规模的扩大，猪体内感染的疾病日益增多，给养猪业生产带来了巨大的经济损失。母猪感染猪细小病毒(PPV)会发生流产、死胎或产仔猪大量死亡，猪场一旦感染，3个月内100％感染，感染猪很长时间带毒、排毒。猪圆环病毒2型(PCV2)具有较强的致病性，可以感染不同日龄的猪。怀孕母猪感染后，经胎盘垂直感染给仔猪，初产母猪和新猪群产生繁殖障碍。这2种疾病在临床上呈现出相似的症状，又常常发生混合感染，使临床诊断非常困难，必须依靠实验室检测技术进行鉴别诊断。猪圆环病毒除导致繁殖障碍性疾病外，还可导致猪群产生严重的免疫抑制，从而容易继发或并发其他传染病。临床上单独圆环病毒感染的发病的病死率很低，80％以上的情况属于继发感染。在猪场中发现，圆环病毒和副猪嗜血杆菌混合感染的较为普遍。副猪嗜血杆菌感染可以引起猪的副猪嗜血杆菌病，以多发性纤维素性浆膜炎和关节炎为主要特点，给养猪生产造成极大损失。

当前国内外对猪病分子检测技术的研究，多集中于猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒等病毒性疾病混合感染的鉴别诊断，而对存在的病毒性疾病和细菌性疾病混合感染的快速诊断未引起重视。实时荧光定量PCR是近几年发展起来的一种定量检测方法，与传统PCR相比具有定量、快速、灵敏性高、特异性强等特点，已经被广泛应用。目前发展起来的多重实时荧光染料PCR技术可以在同一个反应体系中，通过Tm值来区分不同的核酸片段。本发明开发了一种利用Tm值不同实现在一个反应体系中同时检测HPS、PPV和PCV2感染的方法。本发明的建立将为猪场中病原的诊断及疾病的净化提供技术支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种多重实时荧光PCR同时检测3种猪常见病原的方法，该方法在能快速、可靠、灵敏度高、特异性强和价廉的前提下检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、副猪嗜血杆菌这三种猪常见病原。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种多重实时荧光PCR方法同时检测3种猪常见病原的方法，包括以下步骤：

(1)分别设计并合成猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、副猪嗜血杆菌(HPS)的特异性引物；

(2)提取病料样品中的DNA，按照宝生物科技有限公司TaKaRa MiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(cas no:9765)的说明书操作。

(3)将步骤1)所述的所有特异性引物置于多重荧光PCR反应体系中，以步骤2)所述的DNA为模板，进行PCR扩增，根据熔解曲线来分析病料样品中是否携带PCV2、PPV、HPS中的至少一种。

作为本发明的多重实时荧光定量PCR同时检测3种病原的方法的改进：

所述PCV2扩增引物对为：

正向：5'TGCCCTAACCTATGACCC 3'

反向：5'TGTAGTTTGTAGTCTCAGCCAG 3'

扩增片段Tm值为：79.79℃

所述PPV扩增的引物对为：