[发明专利]一种基于固相萃取的液相-液相二维色谱测定NNK及其代谢物的系统和方法

权利要求书

1.一种吸烟者血液和尿液中NNK和NNAL测定方法，其特征在于：适用于基于固相萃取的液相-液相二维色谱测定NNK及其代谢物的系统，包括一级色谱系统和二级色谱系统，一级色谱系统与二级色谱系统之间通过六通阀连接；固相萃取柱设于六通阀上；一级色谱系统包括进样器，进样器一端与第一泵连接，另一端与净化柱连接，净化柱一端检测器连接，检测器一端与三通阀一端连接，三通阀的该端还与第二泵连接，三通阀的另外两端一端为废液出口，另一端连接混合器；第二泵将NNK和NNAL流出部分馏分切割进入固相萃取富集，其余部分则流入废液；二级色谱系统的第三泵与六通阀其中一口连通，另一口与二级色谱系统的分析柱连接，分析柱与检测器连接；

六通阀上设有七个口，分别为第一口至第七口，混合器一端与第七口连通，固相萃取柱两端与第一口和第四口连通；

样品分析时，通过一级色谱系统进样器进样，用检测器指示待测组分的流出时间，待测组分通过三通阀切割，切割的组分经混合器混合，从六通阀的第七口进入，通过第四口流经固相萃取柱，让待测组分富集在固相萃取柱上，同时通过第二泵对切割的组分进行稀释，降低流动相的洗脱强度，保证待测组分在固相萃取柱上不被洗脱而完全富集在固相萃取柱上，经固相萃取捕集后的流动相经第一口和第六口流出进入废液；

其中，待测组分切割、富集完成后，通过六通阀切换，一级色谱系统的流动相通过三通阀进入废液；同时二级色谱系统的流动相从六通阀的第二口进入，通过固相萃取柱，从和富集相反的流向把固相萃取柱上富集的待测组分洗脱下，再从第四口和第三口流出，进入二级色谱系统的分析柱分离，再经检测器检测确定待测成分含量；

包括如下步骤：

(a)、将制备好的样品进样，进样体积为1.0~2.0mL，以含0.01%的乙酸铵的30%乙腈为流动相，安捷伦Zorbax SB-C18，9.4´150mm，5.0µm半制备色谱柱为净化柱，流速为2.0 mL/min净化样品，切割14.2~18.6 min流出的馏分进入固相萃取；

(b)、切割的馏分用第二泵以2.0mL/min左右的流速输送水稀释，经混合器混合后再通过固相萃取柱富集；固相萃取柱材料为 Oasis HLB，粒径为5.0 µm；

(c)、固相萃取富集完成后，通过切换六通阀，以流动相A乙腈和流动相B0.01mol/L的乙酸铵溶液梯度洗脱，以和固相萃取富集相反的流向把固相萃取柱上富集的NNK和NNAL洗脱下来，再经过分析柱分离，质谱检测测定，内标法定量，即可测定吸烟者血液和尿液中的NNK和NNAL；

其中，分析柱为Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1mm i.d.×100 mm，1.7μm；梯度条件为：乙腈、0.01 mol/L的乙酸铵溶液，0至5min流动相A由10%变为80%，6min A由80%变为10%，流动相回到10%的A后平衡5min可进行下一个样品。

2.根据权利要求1所述的吸烟者血液和尿液中NNK和NNAL测定方法，其特征在于：步骤（a）中，样品制备过程如下：

血液和尿液样品采集后，准确移取一定量的样品，加入内标工作液，用甲醇稀释并充分摇匀，保持实际待测样品中甲醇比例为50%，内标浓度为 5ng/L；样品迅速于20000r/min 高速离心10 min；取上层清液过滤，直接供样品分析用。

3.根据权利要求1所述的吸烟者血液和尿液中NNK和NNAL测定方法，其特征在于：步骤（c）中，质谱条件如下：

电喷雾电离源：ESI，检测方式：多反应监测MRM，扫描方式：正离子扫描，电喷雾电压：5000V，离子源温度：600℃，辅助气Gas1压力：0.345MPa，辅助气Gas2压力：0.483MPa。

4.根据权利要求1所述的吸烟者血液和尿液中NNK和NNAL测定方法，其特征在于：NNK和NNAL的工作曲线、线性范围、相关系数、检出限和定量限如下表所示：

分析物	工作曲线	线性范围，ng/L	r]]>	检测限，ng/L	定量限，ng/L
NNK	y=0.0803x+0.0035	0.1-100	0.9992	0.025	0.08
NNAL	y=0.1594x+0.0093	0.2-150	0.9994	0.040	1.22

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