[发明专利]一种不需要预包被的神经元细胞培养方法

说明书

本发明属于细胞生物学技术领域，公开了一种不需要预包被的神经元细胞培养方法。本发明首先对蝶翅进行处理使其呈现透明和亲水性，并保持其原有的表面结构，然后将蝶翅用作神经元培养基质材料进行神经元细胞培养，可以不用预先采用多聚赖氨酸等促粘附试剂包被，就可以直接将分离获得的原代神经元在蝶翅表面进行培养，经光学显微镜、扫描电子显微镜、激光共聚焦显微镜等多种显微镜镜下观察拍照，可见神经元生长状态良好，存活率高。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种神经元细胞培养方法，特别涉及一种以蝶翅作为神经元细胞培养基质材料、不需要预包被的神经元细胞培养方法。

背景技术

神经系统的任务是接收、发放、处理、存储和提取信息，这些任务都是通过其基本单位——神经细胞来完成。由于神经元是形态各异、功能复杂、化学性递质繁多的特化细胞，这就决定了神经元培养的特殊性。神经元是一种较难培养成功的细胞，在体外培养的神经元死亡率较高。现有文献和实验技术操作中提及原代神经元的培养，都建议在培养前，对培养基质(如培养皿、培养板、组织工程材料表面等)进行预先包被，否则神经元不能很好地贴壁粘附生长，死亡率高。用于包被的试剂可以是多聚鸟氨酸、多聚赖氨酸、层粘连蛋白、胶原、鼠尾胶等，这些试剂价格比较贵，需要较长的订货时间，并且需要较复杂的前期处理步骤。例如，通常使用的多聚赖氨酸包被，试剂比较贵，需要在培养神经元前多聚赖氨酸全覆盖培养器皿或基质表面30分钟(室温或37度培养箱中)，过夜晾干，然后洗两次，或者只洗一次但是要30分钟接着晾干，以备使用。由于神经元对生长的基质材料表面特性比较敏感，因此，材料表面的包被物可能会对神经元生长特点等产生影响，使实验结果产生偏差，影响材料的应用效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种不需要预包被的神经元细胞培养方法，该方法利用经过处理的蝶翅作为基质材料进行神经元细胞培养，可以不用预先采用多聚赖氨酸等促粘附试剂包被，就可以直接将分离获得的原代神经元在蝶翅表面进行培养，使神经元生长状态良好，存活率高，可以用于常规实验。

为了解决上述问题，本发明提供了一种不需要预包被的神经元细胞培养方法，该方法采用蝶翅作为神经元细胞培养基质材料，具体包括以下步骤：

S1.将蝶翅以1mol/L的HCl溶液浸没浸泡3小时，双蒸水漂洗多次至PH试纸检测溶液呈中性；

S2.将步骤S1处理得到的蝶翅用2mol/L的NaOH溶液浸没蝶翅，40-60°烘箱中放置12-16小时，至蝶翅接近透明，双蒸水漂洗至PH试纸检测溶液呈中性；

S3.将步骤S2处理得到的蝶翅在75％乙醇溶液中浸泡消毒灭菌，然后在超净工作台中无风状态紫外线照射15分钟消毒灭菌；

S4.将步骤S3处理得到的蝶翅以灭菌双蒸水漂浮，按培养器皿及实验需求剪出所需性状大小的蝶翅作为细胞培养基质，将所述细胞培养基质转移至滴有灭菌水的玻片或装有灭菌水的培养器皿中使其漂浮铺展，小心从边缘吸去所述细胞培养基质下方的水，使所述细胞培养基质在玻片或培养器皿表面平整铺展；

S5.将步骤S4处理得到的铺展有所述细胞培养基质的玻片或培养器皿在超净台中无风干燥5分钟后，吸取热的液体状的琼脂在蝶翅边缘筑坝一圈，使冷却后的琼脂将所述细胞培养基质封固在玻片或培养器皿上并在所述细胞培养基质周围边缘处形成坝体；

S6.将神经元细胞悬液滴加于所述细胞培养基质表面所述坝体的内部区域，然后置于37°二氧化碳培养箱内培养。

优选的，所述蝶翅为大蓝闪蝶蝶翅、天堂凤蝶蝶翅和绿鸟翼蝶蝶翅中的一种。

优选的，所述神经元细胞悬液的制备方法具体为：从胚胎18天或新出生1天大鼠脑的海马或皮层区域组织中分离获得原代神经元，将所述神经元以DMEM/F12培养基重悬，形成神经元细胞悬液；所述DMEM/F12培养基中含有10wt％的FBS和1wt％的青霉素-链霉素。