[发明专利]一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体及其制备方法和应用，属于皮肤修复技术领域。本发明通过Wnt4基因和YWHAZ基因的表达腺病毒载体在间质干细胞中过表达来修饰MSC来源外泌体(MSC‑exosome)，使exosome过表达Wnt4基因和YWHAZ基因，实现MSC‑exosome促进大鼠烫伤皮肤组织的再生修复的药用目的。

技术领域

本发明属于皮肤修复技术领域，具体涉及一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种由于人体内胰岛素分泌的绝对或相对不足而引起的终身性代谢性疾病，属于影响人类健康的重要疾病。糖尿病足部皮肤溃疡(diabetic foot ulcer)是糖尿病最常见和最主要的并发症之一，流行病学调查显示约有1/4糖尿病患者会发生足部溃疡，糖尿病足部溃疡最早发生神经病变，后期发展会导致足部循环障碍，感觉障碍，进一步出现足趾或足部坏疽，最终导致截肢或合并全身严重感染而死亡，因此糖尿病皮肤溃疡较烧伤等其他创伤发病机制复杂且更加难以愈合。现有治疗方法如神经生长因子合并局部换药处理等，仍存在如抗菌药物使用不当，伤口护理和外科干预不当等问题，使得溃疡创面迁延不愈，因此尚需更为有效的解决方案。

Exosome即非可溶性的微囊泡结构是近年来发现的细胞间信号通讯的重要途径，是细胞可溶性细胞因子外的重要旁分泌形式。Exosome的特性主要有：(1)直径为40～100nm；(2)具有来源细胞的胞质和脂质胞膜成分；(3)密度为1.13～1.19g/ml；(4)含有其来源细胞的特异性蛋白及exosome相关蛋白如CD9、CD81、Alix等。Exosome成分主要包括：microRNA，mRNA，mtDNA，蛋白，表面标记等，蛋白组学分析发现exosome的蛋白组成较为复杂，不同细胞来源的exosome蛋白组成亦有差异。

MSC分泌的微囊泡(MSC-exosome)是其旁分泌作用中最有活性成分，已有报道证实MSC-exosome在心、肝、肾、神经系统等组织损伤修复中发挥了重要作用。研究发现，已成功分离纯化不同来源的人骨髓及脐带MSC分泌的exosome，具有促进大鼠皮肤烫伤再生修复的作用(专利号CN201410775694.6)。但是未处理过的hucMSC-exosome治疗效果不佳。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体及其制备方法和应用，Wnt4/YWHAZ共修饰得到的改造后的间质干细胞源外泌体具有较好的促进大鼠烫伤皮肤组织的再生修复的功能。

本发明提供了一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体的制备方法，包括以下步骤：

1)分别构建Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒；

2)用步骤1)构建得到的Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒转染间质干细胞，培养；

3)收集Wnt4和YWHAZ过表达后的间质干细胞培养后的上清液，去除漂浮的活细胞，分离纯化上清液中的外泌体，得到Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体。

优选的，所述Wnt4过表达腺病毒中Wnt4的mRNA变异体的核苷酸序列如序列表SEQID No.1所示。

所述YWHAZ过表达腺病毒中YWHAZ的mRNA变异体的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示。

所述Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒中腺病毒的元件顺序为mCMV-MCS-3Flag-SV40-EGFP。

优选的，步骤2)中所述转染时，Wnt4过表达腺病毒或YWHAZ过表达腺病毒的病毒滴度分别为1～2×10⁸PFU/mL。