[发明专利]寨卡病毒实时荧光定量RT-RPA检测引物和探针及检测试剂盒

权利要求书

1.寨卡病毒实时荧光定量RT-RPA检测引物和探针，其特征在于，上、下游引物和探针序列分别如下：

上游引物：5′-TACAAGTACCATCCTGACTCCCCCCGTAGA-3′

下游引物：5′-ACTCCATTCTCTTCCAGGATTGCATTGAGCT-3′

探针：5′-CCTCTGTTTCAAGAATGGAAAACATCA[FAM-dT][dSpacer][IntBHQ1-dT]GGAGATCAGTAGAAG[C3spacer]-3′。

2.含有权利要求1所述引物和探针的检测试剂或试剂盒。

3.寨卡病毒实时荧光定量RT-RPA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物和探针，还含有逆转录酶、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、标准阳性模板、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、酶扩增八联管中的至少一种。

4.非诊断目的实时荧光定量RT-RPA检测寨卡病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样本的总RNA；

2)配制含有权利要求1所述引物和探针的RT-RPA反应体系，向反应体系中加入上述提取的总RNA，进行反转录和RPA扩增反应；

3)分析扩增产物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)包括：向离心管中加入再水化缓冲液29.2～29.5μL，10μM上、下游引物各2.5μL，10μM探针0.65μL、AMV逆转录酶0.6μL至终浓度6U/μL，40U/μl RNA酶抑制剂0.5μL和ddH₂O 5.85μL，混匀后，将上述混合液加入含有冻干酶球的RPA反应管中，混匀，最后将280mM醋酸镁溶液2.9～3.2μL加至上述反应管中，混匀后将反应管置于等温扩增仪中，于40℃反应120秒。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：根据是否出现扩增曲线，分析待测样本中是否含有寨卡病毒核酸；出现相应的扩增曲线表示待测样本含有寨卡病毒核酸，表现为阳性结果；不出现扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到寨卡病毒核酸，表现为阴性结果。