[发明专利]用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分脑膜炎奈瑟氏球菌与其它球菌属，以及产毒和非产毒的球菌属，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对产毒脑膜炎奈瑟氏球菌进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。

背景技术

脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)是一种革兰氏染色阴性的好氧型双球菌，常呈双排列，直径约为0.8μm。脑膜炎奈瑟菌分解糖类产酸不产气。氧化酶试验阳性。脑膜炎奈瑟菌可产生自溶酶，人工培养时若不及时移种，数日后菌体自溶。脑膜炎奈瑟菌主要抗原包括荚膜多糖抗原、外膜蛋白和脂多糖抗原。根据荚膜多糖抗原性不同，可将脑膜炎奈瑟菌分为至少13个血清群。与人类疾病关系密切的主要是A、B、C、Y及W-135群。脑膜炎奈瑟菌A群及C群是引起脑膜炎流行的主要血清群。

人类是脑膜炎奈瑟菌唯一的易感宿主。细菌由鼻咽部侵入机体，依靠菌毛的作用粘附于鼻咽部粘膜上皮细胞表面。多数人感染后表现为带菌状态或隐性感染，细菌仅在体内短暂停留后被机体清除。只有少数人发展成脑膜炎。我国引起脑膜炎的主要是A群菌，B群常为带菌状态。当脑膜炎奈瑟菌侵入血流时，会引起菌血症，伴随恶寒、发热、呕吐、皮肤出血性瘀斑等症状。

流行性脑膜炎的临床诊断通常以出现发热、呕吐、头痛等临床症状为依据。进一步的确诊则需在病人脑脊液中分离到脑膜炎双球菌。但分离培养方法的检出阳性率较低，并且至少需要2～3天才能确诊感染，这对疾病的及时治疗极为不利。此外，受抗生素使用及其他非特异性因素的影响，分离培养法的灵敏度不高，极大地降低了诊断结果的可靠性。因此，寻找一种快速、灵敏并且适用于临床诊断的检测方法已显得非常紧要。近年来，丰富的基因组数据为分子诊断技术锁定脑膜炎奈瑟菌特异性序列提供了参考数据库。当前，分子生物学技术正以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用于脑膜炎奈瑟菌的诊断检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR方法。

具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、检测脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3以及产毒特异性基因gene4；

S4、读取扩增Ct值；当所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因的Ct值均小于35时，产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的检测结果为阳性；当所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene4的Ct值大于35时，产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因rpoB(NCBIAccession Number：S74030.1)的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示；

SEQ ID NO:1(5'-ATGCGCGCACCAATGATTAC-3')；

SEQ ID NO:2(5'-ATAGCGGCCTTCTTCGATGG-3')。

所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因gene1(NCBI Accession Number：VEJ36534.1)的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示；

SEQ ID NO:3(5'-ACCATCTTGATGACAGCCGG-3')；