[发明专利]一种低内毒素胶原蛋白的制备方法

说明书

本发明属于胶原蛋白制备领域，具体涉及一种低内毒素胶原蛋白的制备方法。本发明通过在胶原蛋白原料处理环节中增加低温碱溶液处理步骤，在保证胶原蛋白活性不被破坏的前提下，制备获得低内毒素的胶原蛋白，该方法对内毒素去除效率高，制备的胶原蛋白内毒素含量显著低于医药行业标准(YY 0954‑2015)规定的0.5Eu/mL；并且本发明提供的方法操作简单方便，成本低，无需特殊的设备，即可除去内毒素，得到低内毒素的胶原蛋白。

技术领域

本发明属于胶原蛋白制备领域，具体涉及一种低内毒素胶原蛋白的制备方法。

背景技术

胶原蛋白是人体含量最高的蛋白质。胶原蛋白作为天然的生物资源，具有合成材料无可比拟的生物活性、生物相容性、生物可降解性和低免疫原性等优点，在组织工程和药物输送等领域广为应用。但是在天然胶原蛋白提取制备过程中，若对内毒素的去除不彻底，会降低胶原蛋白材料的品质，限制胶原蛋白材料在生物医学领域的应用。

目前，研究人员通常采用酸溶酶解法制备胶原蛋白，常用的酸为冰醋酸，酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶等。为了使提取获得的胶原蛋白符合医药应用标准，必须将提取获得的胶原蛋白中的内毒素含量降低到0.5Eu/mL以下。而常用于去除内毒素的方法主要包括阴离子交换色谱法、亲和色谱法、分子筛法、液相分离法、吸附法、蒸馏法等。但是，上述方法均存在很多的缺陷，例如：阴离子交换色谱法对于溶液中存在其它带负电荷物质时的去除效果较差；亲和色谱法相对成本较高；液相分离法在去除内毒素后容易残留去污剂；吸附法对处理量有一定的限制，不利于大规模处理，且操作相对繁琐；蒸馏法的去除效果不佳。

也有一些专利和文献中报道了采用氢氧化钠去除反应容器或样品中内毒素的技术方案，例如，中国发明专利CN201611037916.X提供了一种去除生物制剂原料液以及反应金属杯上内毒素的方法，发明人通过联合高温处理(110-130℃，40-50min)和复合溶液(0.2-0.5M氯化钠溶液中逐滴加入0.1M氢氧化钠溶液，至pH7-8)处理方式，去除生物医药制剂原料液中的内毒素，并且，为了提高去除内毒素的效率，还需高温处理(80-100℃)；虽然这种方法可以较好地去除所述发明中生物制剂原料液中的内毒素，但是这种方法需要对原料液进行高温处理，然后再用含氢氧化钠的复合液处理上述原料液，由此导致原料液中残留大量的钠离子、氯离子。因此，该方法明显不适宜用于去除胶原蛋白中的内毒素，原因如下：①高温导致胶原蛋白变性、分解或失活；②研究人员通常采用碱水解法提取动物组织中的胶原肽，碱性处理条件会使胶原蛋白水解为胶原肽，由此可见，碱处理法普遍不能被用于胶原蛋白的提取过程中；③复合液会使原料液的盐浓度大幅增加，进而影响胶原蛋白质量和稳定性，即使采用额外的脱盐步骤也会使胶原蛋白收率大幅下降。

在中国发明专利CN201110220654.1中，发明人采用氢氧化钠(1.5g/L)处理羟乙基淀粉酸水解液，处理时间0.25-20h，该方法对羟乙基淀粉酸水解液中的内毒素的降低效果达到15％-80％，其中最优处理条件为1.5g/L终浓度氢氧化钠，处理时间2h，处理温度40℃；该技术方案中需要用盐酸溶液调整处理液pH值。该方法也不适宜用于去除胶原蛋白中的内毒素，原因如下：①连续两步碱处理(真空高浓度(29.5g/L)氢氧化钠水解处理-超滤-低浓度(1.5g/L)氢氧化钠处理)的技术方案，增加了操作难度，并且高浓度碱溶液容易导致胶原蛋白变性、分解或失活；②研究人员通常采用碱水解法提取动物组织中的胶原肽，而碱性处理条件会使胶原蛋白水解为胶原肽，由此可见，碱处理法普遍不能被用于胶原蛋白的提取过程中；③对胶原蛋白酶解液和胶原蛋白产品直接进行碱处理，会影响胶原蛋白质量和稳定性，使胶原蛋白收率大幅下降；④由该专利说明书记载可知，所述技术方案对内毒素的降低效率最高为80％，也就是说，即使采用该方法，也无法将胶原蛋白中的内毒素降低至医药行业标准规定的0.5Eu/mL以下。

因此，即使背负很高的处理成本，本领域的研究人员目前仍然选择采用阴离子交换色谱法、亲和色谱法、液相分离法等去除内毒素，以保证胶原蛋白中的内毒素含量符合医药行业标准。