[发明专利]研究家蚕基因抑制BmNPV DNA复制相关基因的表达的方法

说明书

本发明公开了研究家蚕基因抑制BmNPV DNA复制相关基因的表达的方法，所述方法包括以下步骤：(1)引物设计根据质粒克隆所需的步骤，设计合成克隆所用引物；(2)重组质粒构建构建重组质粒pFastBacDual‑polyhedrin‑A3‑Bmlipase‑1；(3)重组病毒构建将步骤(2)制得的重组质粒转化E.coli DH10BacΔEGT细胞以构建重组Bacmid；(4)结果验证验证步骤(3)制得的重组Bacmid对BmNPV DNA复制相关基因的影响；验证DBP的表达量变化；EMSA法验证蛋白质与核酸的相互作用；分析缺失Bmlipase‑1结合位点的dbp启动子活性。与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明在构建可表达Bmlipase‑1的重组病毒的基础上，在细胞内分析Bmlipase‑1对病毒复制相关基因的影响，并运用EMSA研究Bmlipase‑1的作用位点，阐明了Bmlipase‑1抑制BmNPV复制增殖的机制。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种研究家蚕抗病毒相关基因对BmNPV扩增的抑制机制的方法，具体为研究家蚕基因抑制BmNPV DNA复制相关基因的表达的方法。

背景技术

由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)感染引发的家蚕血液型脓病对中国养蚕业造成的经济损失约占蚕病总损失的70％～80％。关于家蚕对BmNPV的抗病机制及抗性基因鉴定一直是蚕业界的重要研究课题，迄今已取得了诸多进展。BmNPV通过食下感染途径进入家蚕消化道后，蚕体对病毒的抵抗分为2个方面：中肠细胞中存在的某些具有阻断病毒侵染的蛋白质如碱性蛋白酶，激活中肠细胞对病毒复制、增殖的阻断机制；当病毒在中肠细胞中复制、增殖，致使中肠细胞破败并扩散到体腔时，家蚕细胞启动凋亡程序，其中消化液中的一些与细胞凋亡有关的重要蛋白质如丝氨酸蛋白酶等发挥抑制病毒复制与扩散的作用。

脂肪酶Ⅰ基因属于α/β水解酶家族。家蚕脂肪酶Ⅰ基因(Bombyx mori lipase-1，Bmlipase-1)在家蚕消化道内发挥着双重作用，在取食阶段发挥水解酶的功能，起着调节生理功能的重要作用；在大量进食期间提高蚕体自身的BmNPV抵抗力，属于免疫机制中不可或缺的重要组成部分。2003年首次分离纯化得到Bmlipase-1，该基因在家蚕中肠组织中特异性表达，且具有很强的抗BmNPV活性。感染BmNPV的家蚕易感品系306的中肠组织中Bmlipase-1有微弱上调(12h)。不同家蚕品系幼虫中肠中Bmlipase-1mRNA的表达量与蚕体自身对BmNPV的抗性呈现正相关，BmNPV感染蚕体后的一定时间段内，可诱导Bmlipase-1的上调表达，而且在抗性越强的家蚕品系中Bmlipase-1的增量表达越明显。Bmlipase-1的过表达可使家蚕幼虫的抗病毒能力提高30％左右。

目前，昆虫对杆状病毒的抗性进行了一些研究。家蚕抑制BmNPV侵染的研究是蚕业界的热点。家蚕中肠、血液中的蛋白质可能通过免疫性活化及细胞凋亡来抑制BmNPV的侵染。明确具有抗BmNPV活性的家蚕蛋白质有Bmlipase-1、BmPP2A、BmPEPCK-2、BmAtlastin-n；BmPGRP2-2可刺激病毒在细胞中的复制；家蚕肠道细菌Bacillus pumilus SW41的脂肪酶基因也具有抗BmNPV活性。然而，这些蛋白质对BmNPV抗性机制尚未完全阐明。转基因细胞系是研究这一问题的有效手段，但是，转基因细胞系的建立需要较长的时间，而昆虫细胞培养存在容易被污染、培养时间长且易退化的特点，故转基因细胞系的建立难度大。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本发明在构建可表达Bmlipase-1的重组病毒的基础上，在细胞内分析Bmlipase-1对病毒复制相关基因的影响，并运用EMSA研究Bmlipase-1的作用位点，阐明了Bmlipase-1抑制BmNPV复制增殖的机制。本研究为鳞翅目昆虫病毒防治提供了新的理论基础，为更深入探讨家蚕基因对病毒的抑制机制提供新的思路。