[发明专利]一种快速在线检测木薯固态发酵的生长过程的方法

权利要求书

1.一种基于拉曼光谱结合嗅觉可视化技术快速在线检测木薯固态发酵的生长过程的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取一批木薯将其干燥至恒重后粉碎分别装入3个装有蒸馏水的锥形瓶中，加入一定量的淀粉酶加热液化，将糖化酶和挑选发育良好的酵母菌种加入冷却至室温后的锥形瓶中以34℃，150r/min进行固态发酵，每隔4h取样一次；

(2)使用DNS溶液检测葡萄糖含量，使用重铬酸钾溶液检测乙醇含量，测量葡萄糖和乙醇的标准曲线；每隔4h抽取样本，测量样本的葡萄糖和乙醇含量，并将整个发酵周期分为3个阶段；

所述步骤(2)的具体过程为：

葡萄糖标准曲线的测量方法为：称取在105℃烘箱中干燥至恒重的葡萄糖粉末0.2g溶于100ml蒸馏水中均匀搅拌，即可得到2mg/ml的葡萄糖溶液，取7支25ml的试管，在每只试管中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2ml上述2mg/ml的葡萄糖溶液，加入适量蒸馏水将其定容至2ml，加入1.5mlDNS溶液并摇匀，在沸水浴中加热3min后取出，用流动冷水将其冷却至室温，每个试管中再加入蒸馏水定容至25ml摇匀，将紫外分光光度计的波长设置为540nm，分别取2.7ml溶液放入比色皿中测量OD值，并做空白调零，保持OD值在0.1～0.7之间，如果超过这个值，按一定倍数稀释再测量，以葡萄糖含量作为横坐标，OD值作为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线；

乙醇标准曲线的测量方法为：取2g无水乙醇放入100ml容量瓶内，加入蒸馏水定容至100ml并摇匀，即可得到20mg/ml的乙醇溶液，取8只30ml的试管，在每只试管中分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2ml上述20mg/ml的乙醇溶液，加入适量蒸馏水将其定容至2ml，加入5ml2％重铬酸钾溶液并摇匀，在沸水浴中加热10min后取出冷却，每个试管中再加入蒸馏水定容至25ml摇匀，将紫外分光光度计的波长设置为600nm，分别取2.7ml溶液放入比色皿中测量OD值，并做空白调零，保持OD值在0.1～0.7之间，如果超过这个值，按一定倍数稀释再测量，以乙醇含量作为横坐标，OD值作为纵坐标绘制乙醇标准曲线；

测量木薯固态发酵中的葡萄糖含量的方法为：首先称取1g固态发酵产物，放入50ml蒸馏水中，在55℃恒温水浴箱中搅拌13min，冷却至室温，然后移出5ml溶液加入10ml离心管中，以11000r/min离心10min，取上清液1ml加入30ml玻璃试管中，再加入适量蒸馏水将其定容至2ml，加入1.5mlDNS溶液并摇匀，在沸水浴中加热3min后取出，用流动冷水将其冷却至室温，每个试管中再加入蒸馏水定容至25ml摇匀，将紫外分光光度计的波长设置为540nm，分别取2.7ml溶液放入比色皿中测量OD值，并做空白调零，保持OD值在0.1～0.7之间，如果超过这个值，按一定倍数稀释再测量；

测量木薯固态发酵中的乙醇含量的方法为：首先称取1g固态发酵产物，放入50ml蒸馏水中，在55℃恒温水浴箱中搅拌13min，冷却至室温，然后移出5ml溶液加入10ml离心管中，以11000r/min离心10min，取上清液1ml加入30ml玻璃试管中，再加入适量蒸馏水将其定容至2ml，加入5ml2％重铬酸钾溶液并摇匀，在沸水浴中加热10min后取出冷却，每个试管中再加入蒸馏水定容至25ml摇匀，将紫外分光光度计的波长设置为600nm，分别取2.7ml溶液放入比色皿中测量OD值，并做空白调零，保持OD值在0.1～0.7之间，如果超过这个值，按一定倍数稀释再测量；根据木薯固态发酵过程中葡萄糖和乙醇的变化情况，将整个发酵时期分为迟滞期、对数期和稳定期3个阶段；

(3)每隔4h抽取样本，放入离心管中离心，取上清液均匀地滴在硅板上，在密封不透光的房间中对木薯固态发酵系统做拉曼光谱检测，每个样本检测三次取平均，将采集到的数据预处理后建立固态发酵过程检测定性模型；根据气相色谱质谱联用仪检测出木薯固态发酵主要挥发性气体挑选出14种卟啉化合物溶于二氯甲烷和1种PH指示剂溶于无水乙醇中做成染料，依次滴在C2反相硅胶板上做成比色传感器阵列；采用嗅觉可视化检测木薯固态发酵系统，每隔4h抽取样本，采集反应前和反应后的比色传感器阵列图像做差，采用图像处理程序将其转化为数字信号，将采集到的数据预处理后建立固态发酵过程检测定性模型；

(4)分别提取拉曼光谱特征变量和嗅觉可视化特征变量，做特征级融合，并建立木薯固态发酵过程检测定性模型，将其与前两种单一技术进行比较；

所述固态发酵时长为72h，采样间隔为4h，共有19个采样时间点：0,4,8，…，72h；每次采样需取出5mg固态发酵样本，并将19个采样时间点分为3段，前7次采样时间点为0,4,8,12,16,20，24h，在锥形瓶I中采样，中间6次采样时间点为28,32,36,40,44,48h，在锥形瓶II中采样，最后6次采样时间点为52,56,60,64,68,72h，在锥形瓶III中采样，按上述采样方法共进行8批平行实验，共获得152个样本数据，将其中的6批共114个样本数据作为训练集，剩余2批共38个样本数据作为预测集；

所述嗅觉可视化检测木薯固态发酵系统中：

根据气相色谱质谱联用仪测量整个发酵过程气味成分的变化情况，筛选出7种主要挥发性气味成分，分别为乙醇、苯乙烯、异丁醇、环五聚二甲基硅氧烷、苯乙醇、乙酸苯乙酯和月桂酸乙酯，针对这些挥发性气味成分，筛选出能与这些气味成分产生敏感反应的14种卟啉材料和1种PH指示剂，具体为：

(1)5,10,15,20-四苯基-21H,23H-卟吩；

(2)5,10,15,20-四苯基-21H,23H-卟吩氯化锰(III)；

(3)5,10,15,20-四(4-甲氧苯基)-21H,23H-卟吩氯化铁(III)；

(4)5,10,15,20-四苯基-21H,23H-卟吩氯化铁(III)；

(5)5,10,15,20-四苯基-21H,23H-卟吩(锌)；

(6)2,3,7,8,12,13,17,18-八乙基-21H,23H-卟吩镍(II)；

(7)5,10,15,20-四(4-羟基苯基)卟吩四甲酯；

(8)5,10,15,20-四苯基-21H,23H-卟吩铜(II)；

(9)2,3,7,8,12,13,17,18-八乙基-21H,23H-卟啉钴(II)；

(10)2,3,7,8,12,13,17,18-八乙基-21H,23H-卟吩锰(III)氯化物；

(11)2,3,7,8,12,13,17,18-八乙基-21H,23H-卟吩；

(12)5,10,15,20-四苯基-21H,23H-卟吩钒(IV)氧化物；

(13)2,3,7,8,12,13,17,18-辛乙基-21H,23H-卟吩钌(II)羰基；

(14)5,10,15,20-四(4-甲氧苯基)-21H,23H-卟吩；

(15)溴百里香酚蓝；

取上述14种卟啉材料各1.8～2mg分别溶于2ml二氯甲烷中，取1.8～2mg PH指示剂溶于2ml无水乙醇中，在温度设置为20℃超声震荡水箱中震荡30min后制成气敏溶液，密封后放入黑盒子，保存在4℃冰箱中；使用时，将气敏溶液恢复至室温，使用内径为0.3mm玻璃点样毛细管吸取大约2ul的气敏溶液依次点样在4cm×3cm的反相C2硅胶板上，制作成5×3的比色传感器阵列，该阵列由14个金属卟啉材料染料和1个PH指示剂染料组成；待色敏材料在反相C2硅胶板上挥发至稳定后装入密封袋中放置于阴暗处保存；

嗅觉可视化检测木薯固态发酵的具体过程为：首先用HP4890扫描仪扫描反应前比色传感器阵列，称取3g木薯固态发酵产物放入直径为60mm的培养皿中，然后将反应前比色传感器阵列固定在保鲜膜上，面朝下固定在30ml培养皿顶部并密封培养皿，保持温度为25℃，湿度为60％的条件下反应5min后取出，再次扫描反应后的比色传感器阵列，最后将反应前后的比色传感器阵列输入电脑中，使用图像处理程序得出差值图像并转化为数字信息，使用主成分分析法使用前6个主成分，建立支持向量机(SVM)定性模型对木薯发酵所处阶段进行分类。