[发明专利]一种过表达胆盐水解酶的重组菌及其构建方法

说明书

一种过表达胆盐水解酶的重组菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。为了解决目前缺乏有效的非药物途径限制饮食过程中胆固醇的摄入量，本发明提供了一种过表达胆盐水解酶的重组菌及其构建方法。本发明所述的降血脂的重组菌是在乳酸乳球菌感受态细胞中过表达胆盐水解酶基因，所述胆盐水解酶基因为来源于嗜酸乳杆菌NCFM。对本发明所获得的重组菌进行诱导表达试验，通过SDS‑PAGE电泳验证，能够获得重组胆盐水解酶蛋白的成功表达。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种过表达胆盐水解酶的重组菌及其构建方法。

背景技术

近年来，不合理的膳食结构逐步导致了人们体内胆固醇含量过量堆积，胆固醇过量堆积将导致冠心病、高血脂症、动脉粥样硬化以及其它心血管疾病。流行病研究表明，我国人群中心脑血管病的患病率、发病率呈不断上升趋势，1992年心脑血管病死亡率占世界人口死亡总数的25％，居各种死因之首。1996年为29％，1999年已达33％。目前，我国这一比例已高达40％，全国每年心脑血管及相关疾病死亡的人数已达200万人，可以说心脑血管病已成为人类第一杀手，而高血脂正是诱发心脑血管病的重要因素之一。对高胆固醇的人来说，降低胆固醇水平意味着减少心脏疾病发生的风险。

人体内血清胆固醇的70％为内源合成，其余30％为膳食胆固醇。目前研究认为人体内胆固醇的合成速度受膳食胆固醇的影响很大。因此，人们尤其希望通过非药物途径限制饮食过程中胆固醇的含量。国内外大量临床实验证实，服用乳酸菌及其相关制品具有减少人体血清胆固醇含量，降低心血管疾病发病率的功效。体外研究发现，乳酸菌产生的胆盐水解酶可以使结合胆酸分解为游离胆酸，游离胆酸与胆固醇形成复合物共同沉淀下来，从而导致环境中胆固醇含量的降低。随着基因工程技术的迅猛发展和食品级乳酸菌研究的深入，利用食品级乳酸乳球菌表达胆盐水解酶来降血脂有良好的前景。

发明内容

为了解决目前缺乏有效的非药物途径限制饮食过程中胆固醇的摄入量，本发明提供了一种过表达胆盐水解酶的重组菌及其构建方法。

本发明所述重组菌过表达胆盐水解酶基因，宿主菌为乳酸乳球菌。

优选的，所述胆盐水解酶基因为来源于嗜酸乳杆菌NCFM，序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的过表达胆盐水解酶的重组菌的构建方法，步骤如下：

(1)根据胆盐水解酶基因序列设计引物对；

(2)对嗜酸乳杆菌NCFM进行基因组DNA的提取；

(3)以步骤(2)提取的DNA为模板，步骤(1)所述引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；

(4)将步骤(3)获得的PCR产物与克隆载体进行连接，筛选获得含有胆盐水解酶基因的克隆载体；

(5)使用限制性内切酶对步骤(4)的克隆载体进行酶切，获得含有胆盐水解酶基因的DNA酶切片段，然后与经具有相同酶切位点的限制性内切酶双酶切的表达载体pNZ8148进行连接，获得含有胆盐水解酶基因的表达载体；

(6)将步骤(5)获得的含有胆盐水解酶基因的表达载体转化入乳酸乳球菌感受态细胞中，获得含有携带胆盐水解酶基因的乳酸乳球菌。

优选的，步骤(4)所述的克隆载体是pSIMPLE19 EcoRV/BAP。

优选的，步骤(5)所述的限制性内切酶是NcoI和HindIII。

优选的，步骤(6)所述的乳酸乳球菌感受态细胞是乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000。

优选的，步骤(7)所述的转化是电转化法。

优选的，步骤(8)所述的培养是在GM17培养基中，30℃条件下培养20-26小时。