[发明专利]一种特异靶向小鼠G6pc基因的sgRNA导向序列及其应用

说明书

本发明公开了一种特异靶向小鼠G6pc基因的sgRNA导向序列及其应用，属于医学遗传学和分子生物学技术领域。所述sgRNA对应的核苷酸序列含有SEQ ID NO.2所示序列，本发明还公开了利用上述的特异靶向小鼠G6pc基因的sgRNA导向序列编辑小鼠G6pc基因的方法。本发明的sgRNA导向序列可以介导Cas9蛋白，高效地切割靶点DNA，进而用于编辑小鼠G6pc基因，影响小鼠G6pc基因编码蛋白的功能。该sgRNA导向序列可以通过CRISPR/Cas9系统实现高效打靶，效率为100％。

技术领域

本发明涉及一种特异靶向小鼠G6pc基因的sgRNA导向序列及其应用，属于医学遗传学和分子生物学技术领域。

背景技术

成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,associated RNA guided endonuclease Cas,CRISPR/Cas)是细菌和古细菌在长期进化过程中形成的抵御外来遗传物质的获得性免疫防御系统。其中，II型CRISPR/Cas9系统结构较为简单，通过基因工程改造，被广泛用于各个物种的基因编辑。该系统包含Cas9蛋白和sgRNA两个元件，sgRNA通过碱基互补配对的方式靶向结合在基因组DNA长度约为20nt的互补序列上，介导Cas9蛋白的HNH活性位点和RuvC活性位点切割DNA双链，导致DNA双链断裂。细胞通过非同源末端连接或同源重组的方式修复DNA双链断裂损伤，修复时核苷酸会在断裂处随机的插入或缺失或同源重组插入，导致修复后的序列与原序列并不完全一致，进而达到基因编辑的目的。与ZFN和TALENs相比，CRISPR-Cas9具有更快速、简便、高效、多位点、特异性靶向敲除基因的优势。

sgRNA，即single guide RNA的简称，中文名称为向导RNA。Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA--crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(transactivating crRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(single guideRNA)。因此，sgRNA能否做到高效靶向目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性编辑目标基因的先决条件，尤其是基因敲除和基因敲入，sgRNA的高效性对其影响至关重要。因此，能够设计、制备出高效靶向目标基因的sgRNA是基于CRISPR-Cas9系统进行基因编辑的关键。

人G6PC基因编码葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)。G6Pase是一种水解磷酸化合物的磷酸酶，主要在肝组织中表达，可以将葡糖-6-磷酸水解为葡萄糖，促使葡萄糖进入血液，从而调控血糖浓度，维持血糖平衡，是糖代谢的关键酶。G6PC基因突变后可导致蛋白功能失常，引起Ⅰ型糖原贮积病。本病为常染色体隐性遗传，两性均可罹病。临床症状表现为葡萄糖稳态受损、空腹低血糖、生长迟缓、肝肿大、肾病、高脂血症、高尿酸血症和乳酸血症等，目前尚无良好治疗方法。

G6pc基因突变是人类I型糖原贮积症的主要病因，其突变具有多种类型，包括点突变、同义突变、无义突变和错义突变，不同的突变引起的临床症状不同，有些不患病，有些患病，患病程度亦不相同。因此，有必要筛查明确的、典型的G6PC致病突变位点，并将突变位点定位于小鼠基因组上，然后通过CRISPR/Cas9系统对该位点进行打靶，可以建立G6pc基因突变细胞模型或动物模型，从而精准的模拟I型糖原贮积病，为深入的理解G6PC基因的致病机制以及探索可行的治疗策略具有重要意义。然而，目前并没有针对小鼠G6pc基因的sgRNA导向序列以及敲除该基因的方法。鉴于此，有必要提供一种可以模拟人类致病突变的特异靶向小鼠G6pc基因的sgRNA导向序列及利用其特异性敲除G6pc基因的方法，以解决现有技术的不足。

发明内容