[发明专利]一种特异靶向小鼠Tyr基因的sgRNA导向序列及其应用

说明书

本发明公开了一种特异靶向小鼠Tyr基因的sgRNA导向序列及其应用，属于医学遗传学和分子生物学技术领域。所述sgRNA对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中的任意一种序列。本发明还公开了利用上述的特异靶向小鼠Tyr基因的sgRNA导向序列编辑小鼠Tyr基因的方法。本发明的sgRNA导向序列可以介导Cas9蛋白高效地切割靶点DNA，进而用于编辑小鼠Tyr基因，影响小鼠Tyr基因编码蛋白的功能。本发明的sgRNA导向序列可以通过CRISPR/Cas9系统实现高效打靶，效率均为100％。

技术领域

本发明涉及一种特异靶向小鼠Tyr基因的sgRNA导向序列及其应用，属于医学遗传学和分子生物学技术领域。

背景技术

CRISPR/Cas系统最早在细菌中被发现，其在真细菌和古细菌中行使获得性免疫功能，可抵抗外源病毒和质粒入侵。人们通过基因工程手段对微生物自身的CRISPR/Cas系统进行改造，从而创造了可广泛应用于高等生物的基因编辑的打靶系统，CRISPR/Cas9系统。该系统自2012年问世以来，其为生命科学以及生物医学研究注入了强大的动力，成为近年来的研究热点。2013年起，研究者们利用CRISPR/Cas9的DNA结合活性与内切酶活性，成功地在哺乳动物细胞中对基因组进行了编辑。在CRISPR/Cas9系统中，Cas9内切酶在单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA)的指引下，通过碱基互补配对原则，结合到基因组靶点位置，产生双链DNA断裂(DSBs)，从而引发细胞内的修复机制，即非同源末端连接途径(NHEJ)或同源重组定向修复(HDR)，在修复过程中发生碱基的缺失或插入，最终达到基因编辑的目的。Cas9蛋白结合靶点的关键是sgRNA(与靶点互补的序列约20bp)，仅改变sgRNA序列，即可对感兴趣的几乎任意基因组区域进行编辑。与应用较早的基因编辑技术如锌指蛋白核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/Cas9系统具有设计灵活、成本低、操作简单、准确性高、可多位点同时打靶等优势。

sgRNA中文名称为向导RNA。原核生物中Cas9靶向切割DNA是需要两种小RNA--crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(transactivating crRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。目前，通过基因工程手段将这两种小RNA融合为一种RNA，即sgRNA。sgRNA的主要功能是识别和结合到目标基因组DNA上，并介导Cas9蛋白切割DNA双链。因此，sgRNA能否做到高效靶向识别和结合目标基因是CRISPR/Cas9能否特异性编辑目标基因的先决条件，尤其是基因敲除和基因敲入，sgRNA的高效性对基因打靶的影响至关重要。因此，能够设计、制备出高效靶向目标基因的sgRNA是基于CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的关键。

人类白化病是以黑色素缺乏或缺失为主要临床表现的疾病。通常，白化病为常染色体隐性遗传，发病率为1：17000。该病累及眼部和皮肤，眼部的临床表现常为虹膜呈浅灰色或浅粉色，视网膜常表现为少色素或无色素。此外，患者也常有视力不佳、畏光、眼球震颤等症状。皮肤病变表现为色浅、毛发呈白色或黄色。由于该病患者缺乏黑色素的保护，日晒后易诱发皮肤癌。据报道，中国的白化病群体人数众多，目前主要通过遗传咨询、禁止近亲结婚以及产前诊断等多种方法进行预防，但对已病患者仍无有效治疗手段。