[发明专利]特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体及其应用

说明书

特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。本发明通过磁珠‑SELEX技术，将包含35个随机核苷酸的ssDNA初始文库进行PCR扩增后固定在链霉亲和素修饰的磁珠上，加入甲硝唑将与之有亲和力的ssDNA竞争下来，扩增后再投入下一轮筛选。经过十轮筛选及克隆测序获得39条甲硝唑适配体序列，进一步亲和力评估后挑选出ap2、ap19、ap21、ap32四条亲和力较高的序列，其中ap32具有亲和力高、特异性高、结构稳定等优点被选作最优甲硝唑适配体。本发明为甲硝唑检测提供了性能优良的识别元件。

技术领域

本发明涉及一种特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。

背景技术

甲硝唑属于硝基咪唑类抗生素，是人工合成的具有5-硝基咪唑基本结构的抗菌抗原虫药物，该药物也能作为禽类、畜类以及水产养殖的饲料药物添加剂，并且被广泛用于预防和控制蜂箱中的蜜蜂微孢子虫。但研究表明，甲硝唑存在致畸、致癌、致突变的潜在风险和遗传毒性，不合理使用甲硝唑可能导致可食性动物组织中的药物残留，甚至污染水源。1999年，我国农业部发布17号文《动物性食品中兽药最高残留限量》规定甲硝唑在所有食品动物可食性组织的最高残留限量为零。2002年3月，国家开始对此类化合物进行严格控制，农牧发[2002]1号文件《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》规定了在食源性动物中禁用甲硝唑和二甲硝咪唑，在中华人民共和国农业行业标准NY 5030-2006无公害食品畜禽饲养兽药使用准则和NY/T472-2006绿色食品兽药使用准则中规定，禁止以促生长为目的在所有食品动物中使用甲硝唑、二甲硝唑及其盐、酯和制剂禁用于所有食品动物促生长。因此，检测食品动物、饲料及相关产品中甲硝唑的含量，对保障食品质量安全具有重要意义。

目前国内外报道甲硝唑残留的检测方法主要有高效液相色谱法、极谱分析法、分光光度法、薄层色谱法、化学发光法、免疫检测法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法、光谱法、伏安法等。仪器分析方法灵敏度高，准确性好，但设备昂贵难以普及，对实验人员要求较高，对样品的预处理比较复杂，并且分析费时，难以满足轻便高效的现场检测。免疫分析法检测甲硝唑主要方法是酶联免疫法。酶联免疫法是利用结合抗体抗原免疫反应与酶催化反应检测甲硝唑，通过抗体（抗原）与酶结合形成酶标记复合物，酶标记复合物在相应的底物中催化反应，通过电信号、光信号或肉眼识别达到检测目的的检测分析技术。目前市场上已有一些针对甲硝唑残留检测的ELISA试剂盒产品，不过价格昂贵，酶标抗体的种类有限，并且由于甲硝唑是小分子化合物，本身不具有免疫原性，生产与应用存在较多的限制。这些都在很大程度上限制了免疫分析方法在甲硝唑检测中的应用。

指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands byexponential enrichment，简称为SELEX）是一种从含有随机序列的初始文库中体外筛选能与靶分子特异性结合的核苷酸序列的分子生物学技术，通常具有纳摩尔到皮摩尔的亲和力。SELEX基本原理是构建人工合成的随机寡核苷酸文库，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸序列，经反复扩增，多轮筛选，即可得到与靶分子强亲和力高特异性的寡核苷酸序列，筛选出的寡核苷酸被称为适配体。SELEX筛选技术具有靶分子广，亲和力高、特异性高，筛选周期短，可代替抗体的特点。

本发明通过磁珠-SELEX技术，将双链DNA分子中反义链的末端修饰生物素，利用链霉亲和素与生物素之间极高的亲和力，使双链DNA结合在磁珠表面，然后再与靶分子孵育，与靶分子有较高亲和力的ssDNA被靶分子从互补链中竞争性脱离互补链和磁珠，通过磁力架将ssDNA和磁珠分离。经过多轮筛选得到与甲硝唑高特异结合的ssDNA适配体序列，并挑选ap2、ap19、ap21、ap32四条具有高度相似的二级结构的ssDNA适配体序列进行解离常数测量，得到最优适配体ap32。本发明为甲硝唑检测提供了稳定性良好、亲和力高、易制备、易修饰和标记的高特异性适配体序列。

发明内容