[发明专利]一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用，属于生物工程领域。本发明通过对谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶基因lysC进行定点突变，解除了产物的反馈抑制，并通过置换启动子强化突变的LysC的表达。进一步，通过置换启动子进一步强化宿主菌的磷酸戊糖途径以满足四氢嘧啶高效合成中对还原力NADPH的需求。最后，将来源于施氏假单胞菌P.stutzeri的四氢嘧啶合成基因簇ectABC转入上述重组菌获得四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌。本发明的重组谷氨酸棒杆菌可以利用葡萄糖和玉米浆等廉价原料高效合成四氢嘧啶，与重组大肠杆菌生产菌株相比具有更好的生物安全性，对四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用具有重大意义。

技术领域

本发明涉及一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用，属于生物工程领域。

背景技术

四氢嘧啶是一种广泛存在于耐盐及嗜盐微生物中的相容性溶质，四氢嘧啶作为一种渗透压调节物质具有稳定蛋白质、核酸、生物膜以及整个细胞的功能，可以增强细胞在多种逆境(如高盐、热、干燥和冷冻等)中的耐受性。因此，在医药、美容以及酶制剂等众多领域展现出重要的应用价值和广泛的应用前景。

目前，四氢嘧啶主要是利用嗜盐微生物通过“细菌挤奶法”发酵生产，通过高盐诱导合成、低盐释放，渗透压多次循环冲击实现四氢嘧啶的胞内积累和分泌。该方法虽然可以获得较高的产量，但复杂的工艺流程对生产设备的要求高，高盐浓度的培养基不仅会腐蚀设备而且会增加下游纯化的难度，导致生产成本居高不下。

目前虽然已开发出利用重组大肠杆菌在低盐条件下合成四氢嘧啶的方法，避免了使用高盐培养基带来的一些弊端，但由于大肠杆菌本身会产生内毒素，并且大肠杆菌大规模发酵经常面临噬菌体污染的问题，因此，严重制约了大肠杆菌用于四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用。与大肠杆菌相比，谷氨酸棒杆菌作为另一种成熟的工业微生物生产菌株，具有发酵稳定、不产内毒素的特点，是公认的安全菌株，因此，开发一种四氢嘧啶谷氨酸棒杆菌高产菌株从而简化生产工艺、提高合成效率、降低生产成本，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意义。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是利用重组大肠杆菌发酵生产四氢嘧啶时，存在的内毒素、噬菌体污染问题。

[技术方案]

本发明提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，能够用于合成四氢嘧啶，所述重组谷氨酸棒杆菌表达了来自耐盐细菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC。进一步地，所述重组谷氨酸棒杆菌中lysC基因编码的天冬氨酸激酶发生了定点突变，第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸。进一步地，所述重组谷氨酸棒杆菌中编码天冬氨酸激酶的基因lysC的启动子被替换为谷氨酸棒杆菌强组成型启动子Pglya。进一步地，所述重组谷氨酸棒杆菌中的磷酸戊糖途径基因簇的启动子被替换为谷氨酸棒杆菌强组成型启动子Pglya。

在本发明的一种实施方式中，所述四氢嘧啶合成基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中的27～2294bp。

在本发明的一种实施方式中，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主。

在本发明的一种实施方式中，表达耐盐细菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC时，以质粒pXMJ19为表达质粒，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主。

在本发明的一种实施方式中，定点突变的编码天冬氨酸激酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10的209～1474bp所示。可以利用Gibson Assembly构建含突变位点序列的同源重组片段，通过同源重组将谷氨酸棒杆菌基因组上编码天冬氨酸激酶的基因置换为发生定点突变后的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子Pglya的核苷酸序列如SEQ ID NO.10中的1～176bp所示。