[发明专利]小鼠巨细胞病毒核酸检测方法

权利要求书

1.小鼠巨细胞病毒核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、标准质粒的构建，其包括：

S1.1、培养小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞株获得单层小鼠NIH/3T3细胞，

向单层小鼠NIH/3T3细胞中接种小鼠MCMV Smith病毒株，培养得病毒感染液，病毒感染液提取获得MCMV DNA产物；

S1.2、以MCMV DNA产物作为模板进行PCR扩增，获得MCMV-ie基因引物扩增产物；

S1.3、MCMV-ie基因引物扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的DNA，得切胶回收产物，切胶回收产物连接PMD-18T载体，得连接产物，连接产物转化后进行质粒DNA提取，得标准质粒；

S2、检测标准曲线的构建，具体为：将标准质粒用ddH₂O进行5倍系列稀释，得五个梯度的稀释液，以稀释液作为模板，进行荧光定量PCR，建立以起始模板对数为X轴、C_T值为y轴的标准曲线；

S3、待检测样提取获得待检测DNA产物，以待检测DNA产物作为模板进行PCR扩增，获得待检测DNA基因引物扩增产物，待检测DNA基因引物扩增产物进行荧光定量PCR，获得C_T值，并依据标准曲线获得待检测DNA基因引物扩增产物浓度，以定性及定量检测待检测样中的小数巨细胞病毒。

2.如权利要求1所述的小鼠巨细胞病毒核酸检测方法，其特征在于，步骤1.2具体为：依据MCMV DNA产物设计得上游基因引物、下游基因引物；

确定反应体系，其中，每50μL的扩增体系包括39.5μL的ddH₂O、2μL的浓度为50ng/μL的DCMV DNA产物、0.5μL的酶E、1μL的浓度为10uM的下游基因引物、1μL的浓度为10uM的下游基因引物、1μL的dNTP、5μL的10×PCR buffer；

根据反应体系依次向PCR试剂管中加样，将加好样品的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置PCR扩增循环参数进行扩增反应，得到MCMV-ie基因引物PCR扩增产物，存于4℃，其中，PCR扩增循环参数具体为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s，共35个循环；72℃延伸10min；

其中，上游基因引物的序列为：5-TCAGCCATCAACTCTGCTACCAAC-3；

下游基因引物的序列为：5-ATCTGAAACAGCCGTATATCATCTTG-3.。

3.如权利要求1所述的小鼠巨细胞病毒核酸检测方法，其特征在于，步骤S1.3中切胶回收具体包括：

a、从琼脂糖凝胶中切下含目的DNA片段的胶块，放入离心管中，并称量；

b、按照与胶块的质量体积为1mg:1mL加入溶胶液PN，50℃水浴加热至胶块完全溶解，得胶块溶解液，其中，水浴期间每隔2-3min颠倒离心管一次；

c、将平衡液BL加到吸附柱中，静置2min，离心，弃去滤过液；

d、将胶块溶解液加到吸附柱中，离心，弃去滤过液；

e、向吸附柱中加入漂洗液PW，离心，弃去滤过液，重复该操作2次，得空载吸附柱；

f、将空载吸附柱进行空转离心，弃去滤过液，并将吸附柱在室温下放置晾干；

g、向膜中间悬空加入洗脱缓冲液EB，离心收集DNA滤液，得切胶回收产物。

4.如权利要求3所述的小鼠巨细胞病毒核酸检测方法，其特征在于，步骤S1.4中切胶回收产物连接PMD-18T载体具体为：

在EP管中配置连接体系，其中，每10μL的连接体系包括：1μL的PMD-18T载体、1μL的切胶回收产物、3μL的Solution Buffer、5μL的ddH₂O；

将装载有连接体系的EP管置于16℃反应30min，得连接产物。