[发明专利]一种热稳定的双功能谷胱甘肽合成酶突变体及其应用

说明书

本发明公开一种双功能谷胱甘肽合成酶的突变体，所述突变体为将SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1的氨基酸序列进行重组，和/或对重组体进行定点突变，获得如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列或其突变体。本发明的优点在于：本发明的突变体的热稳定性都得到了显著的提高，半衰期t_1/2分别是野生酶10‑60倍。最优突变体的半衰期t_1/2是野生酶的163.3倍，比酶活比野生酶提高了24％。与野生酶相比，最优突变体的最适温度从45℃提高到了50℃。通过酶催化、胞内自组装全细胞催化以及发酵等试验证明，最终得到的突变体有效地提高了GSH的产量和合成效率。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及对不同来源的双功能谷胱甘肽合成酶基因进行DNA重组、定点突变、多位点突变，以及重组突变体在谷胱甘肽生物合成中的应用。

背景技术

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的一种含有巯基的生物活性三肽化合物。在生物体内，谷胱甘肽有着多种重要的生理功能。谷胱甘肽能参与体内氧化还原过程，结合过氧化物及自由基以对抗氧化剂对巯基的破坏,同时还可对抗自由基对重要脏器的损害。此外谷胱甘肽在消除人体自由基，提高人体免疫力，抗衰老，在老人迟缓化的细胞上所发挥的功效比年轻人大，谷胱甘肽对于治疗放射线、放射性药物所引起的白细胞减少等症状也都具有非常显著的效果。

酶法合成谷胱甘肽主要是以L-谷氨酸，甘氨酸，L-半胱氨酸三种氨基酸为前体，在ATP和Mg²⁺以及合适的温度以及pH条件下，经过酶的催化作用而生成GSH。2005年以来多种来源的双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)相继被发现，该酶同时具有γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GC)合成酶(γ-GCS)活性和谷胱甘肽合成酶(GS)活性。张星等(J.Biotechnol.2017；(241)：163-169)通过将重组GshF与多聚磷酸激酶相结合，体外组成一种ATP再生系统生产GSH的方式，在45℃条件下反应5h时GSH的积累量达到了28.5mM，基于半胱氨酸的得率达到了81.4％。但是由于酶的活力和稳定性限制，酶法在工业上的大规模实际应用很少。

通过蛋白质工程对酶进行改造，可以有效地改良相关酶的性质。刘等(Appl.Microbiol.Biotechnol.2019；(103):265-277)以来源于未培养细菌的野生型4-脯氨酸羟化酶为对照，将能够提高热稳定性以及活性的一段loop结构替换成四种不同来源的4-脯氨酸羟化酶的loop结构，最终得到一株最优体，酶活提高了2倍；孙等(ProteinExpression Purif.2005；(42):122-130)通过不同来源酶的N端替换，将来自Aspergillusniger的木聚糖酶A(AnxA)的N端替换成来源于Thermomonospora fusca木聚糖酶A(TfxA)的N端得到ATx，相比于初始的两种木聚糖酶，最终酶的活性分别提高3.6倍和5.4倍。此外，通过对折叠自由能的计算也可以对酶的热稳定性改造提供一定的理论依据，Yu等(Sci.Rep.2017；(10):1038)通过对ΔΔG的计算，筛选到一些潜在的可以提高酶热稳定性的突变点，最终通过筛选，酶在60℃的半衰期提高了3倍，比酶活也提高了5倍。

目前在提高酶的热稳定性和活性等方面有许多方法，对此我们希望通过对双功能谷胱甘肽合成酶基因进行DNA重组以及定点突变和多点突变，使其在提高酶热稳定性的同时还能够保持其优异的催化性能，能够满足工业化生产的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶热稳定性高，同时还能够保持其优异的催化性能的双功能谷胱甘肽合成酶的突变体。

本发明的第二个目的在于提供所述双功能谷胱甘肽合成酶的突变体的应用。

为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种双功能谷胱甘肽合成酶的突变体，其特征在于，所述突变体为将SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1的氨基酸序列进行重组，和/或对重组体进行定点突变，获得如SEQ ID NO.3所示或其突变体。