[发明专利]野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的编码基因与应用

权利要求书

1.野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的编码基因，其特征在于，VdANK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，长度1812bp，开放阅读框从第108~1442位碱基，它所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该蛋白质的分子量为67.15，等电点为6.47，包含有两个Ankyrin repeat保守结构域。

2.根据权利要求1所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1VdANK1的表达载体，其特征在于：表达载体含有如SEQ ID NO：1所示的野葡萄抗病相关锚定重复蛋白VdANK1的开放阅读框。

3.根据权利要求2所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pCAMBIA2301- VdANK1，其制备步骤如下：

（1）以葡萄cDNA为模板，P1、P2为引物，PCR扩增得到VdANK1基因的开放阅读框，将扩增片段连接到pMD19-T克隆载体上，筛选得到阳性质粒pMD19-T-VdANK1；

正向引物P1：5’-GGGAGATCT-3’，

反向引物P2：5’-GGGGGTGACC-3’；

P1下划线处为酶切位点Bgl II，P2下划线处为酶切位点BstE II；

（2）用Bgl II、BstE II分别双酶切阳性质粒pMD19-T- VdANK1和植物表达载体pCAMBIA2301，回收目标片段与线性化载体，连接、转化后筛选、验证，即得。

4.根据权利要求3所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的表达载体，其特征在于：将植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化农杆菌。

5.根据权利要求3所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的表达载体，其特征在于：所述野葡萄抗病相关锚定重复蛋白VdANK1的分离克隆方法包括：

（1）采用SDS/酚法提取葡萄叶片总RNA；

（2）纯化总RNA；

（3）以RNA为模板反转录合成cDNA第一链；

（4）以cDNA为模板进行PCR扩增；

（5）检测与回收。

6.根据权利要求2或者3任一所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1编码基因的应用，其特征在于：将植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入植物，包括

（1）植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入拟南芥；

（2）植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入葡萄。

7.根据权利要求6任一所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1编码基因的应用，其特征在于：所述植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入拟南芥的步骤包括：

（1）将转化植物表达载体pCAMBIA2301-VdANK1的农杆菌接种至10mL LB液体培养基中进行培养；

（2）将菌液转移至离心瓶或离心管中进行离心处理后收集菌体，并重悬于渗透缓冲液中；

（3）将去除果荚的南芥花浸入渗透缓中，浸透结束后清理掉南芥花上多余的渗透缓冲液，将南芥花放入培养箱中继续培养。

8.根据权利要求6任一所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1编码基因的应用，其特征在于：所述植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入葡萄的步骤包括：

（1）将转化植物表达载体pCAMBIA2301-VdANK1的农杆菌接种至10mL LB液体培养基中进培养；

（2）将菌液转移至离心瓶或离心管中进行离心处理后收集菌体，加入相同体积的渗透缓冲液重悬；

（3）将葡萄叶片置于适量的重悬液中，置于水式真空循环泵中进行抽真空处理，将处理好的葡萄叶片取出并除去叶片表面的菌液，将葡萄叶片置于培养箱中培养。