[发明专利]一种DNA恒温扩增方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种DNA恒温扩增方法，所述方法包括：（1）制备反应混合物；（2）将步骤（1）获得的反应混合物置于恒定温度下，在识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能DNA聚合酶的作用下，第一引物对和第二引物对以模板进行DNA扩增。本发明还涉及一种用于实施DNA恒温扩增方法的试剂盒。本发明所述的方法和试剂盒引物设计简单、能够在恒温下进行DNA扩增且扩增灵敏高效。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种DNA恒温扩增方法及试剂盒。

背景技术

随着分子生物学技术的迅速发展，核酸已经成为生物学研究和疾病诊断中的重要生物标志物，并已建立起大量基于核酸检测的分析方法。体外核酸扩增是核酸分析中的一个重要环节，是方法灵敏度、特异性等重要技术参数指标的保证。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是目前最常见的核酸扩增技术，已成为分子生物学、基因组学、疾病诊断等领域的基本研究手段。PCR反应过程包括变性、退火和延伸三个阶段，因此该技术依赖于特殊精密的热循环设备，对操作要求高且耗时可长达2-3小时，从而限制了该技术在资源有限或实地分析中的应用。

近年来迅猛发展起来的恒温扩增技术有望成为未来分子生物领域中核酸扩增分析的新趋势。顾名思义，恒温扩增即指在恒定温度下完成核酸的扩增反应，故而只需简单的恒温装置，如水浴锅等。同时，因不再依赖变性、退火和延伸等多个阶段的反复操作，恒温扩增技术也有了提高扩增效率、于更短时间内完成核酸扩增的可能。

以环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）为代表，恒温扩增已在分子生物学、生物医学等领域有了较为广泛的应用。但目前现有的恒温扩增技术因其技术特点依然存在着各种局限性，例如，在中国专利申请CN1415020A公开的环介导等温扩增技术中，引物组需覆盖六至八个不同的特异序列区间，因而易受到待测序列的限制，可能无法设计出合适的引物组合，而使方法受限无法使用。并且，在LAMP中，随着循环次数增多，单链扩增产物中待扩增DNA的拷贝数不断增加，使扩增产物的分子量不断增大。LAMP产物复杂，很难对产物实施进一步的序列特征等相关的分析，导致后续应用复杂，不太容易进一步实施多重序列的同时分析。滚环扩增技术（rolling circleamplification，RCA）依赖于环状模板，但绝大多数基因组DNA为线性分子，且合成滚环扩增锁式探针的成本高，存在信号背景问题。链置换扩增技术（strand displacementamplification，SDA）需要经过DNA单链模板的准备、5’端3’端均含酶切位点的目的DNA片段的生成和链置换反应多个阶段，且需要经修饰的dNTP作为底物、靶序列准备复杂。依赖解旋酶的扩增技术（helicase-dependent amplification，HDA）则受到DNA解旋酶的限制，主要用于扩增小片段的DNA序列；而重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymeraseamplification，RPA）虽然有极高的扩增效率，却不适合短靶序列的扩增，且反应条件苛刻。

因此，当前急需发展新型的恒温扩增方法，以克服现有核酸扩增技术的一个、多个或全部不足之处，从而扩大核酸分析技术在分子生物学与疾病诊断等相关领域的应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种简单、高效、特异性好且灵敏度高的DNA恒温扩增方法。

本文所述的常规DNA碱基是指腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C），本文所述的非常规DNA碱基是指除腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）之外的DNA碱基。

本发明所述的DNA恒温扩增方法包括：