[发明专利]用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒

说明书

本发明公开用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒，属于生物检测技术领域。以高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌基因组中ampR基因序列为标志物，并以该特异性序列设计引物，最后基于聚合酶链反应，完成对高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的定性检测，以弥补现有技术中肺炎克雷伯菌定性检测方法只能通过是否为粘液型来判断肺炎克雷伯菌的毒力，而无法区分非粘液型菌株中的毒力差异，从而保证了检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的标志物、试剂盒及使用方法的临床应用价值。

技术领域

本发明涉及用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒，尤其涉及一种用于检测肺炎克雷伯菌毒力水平的试剂盒及其使用方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

肺炎克雷伯菌为革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科、克雷伯菌属，广泛分布于自然界，该菌近年来成为仅次于大肠杆菌的最重要的条件致病菌，主要存在于人体上呼吸道和肠道，属于条件致病菌，即一般情况下，肺炎克雷伯菌不致病，当机体免疫力低下或长期使用抗生素导致菌群失调时可引起感染。肺炎克雷伯菌包括高毒力肺炎克雷伯菌和低毒力（普通）肺炎克雷伯菌，其中，两者区别在于：一、前者可感染无基础疾病的年轻人群，而后者多发生在长期卧床或住院的免疫力低下的患者，主要引起院内感染，威胁重症病人；二、前者感染多以原发性肝脓肿为首要症状，并可转移感染，导致其他组织的感染包括脾肝脓肿、肺炎等严重社区获得性疾病，并能转移播散感染；三、前者培养后的菌落多为高粘液性，所以前者也被称为高黏性肺炎克雷伯杆菌，实验室用拉丝试验来测定肺炎克雷伯杆菌的黏性来判定是否为高毒力肺炎克雷伯菌。

目前，有关高毒力肺炎克雷伯菌的菌株鉴定尚无统一标准，通常以临床上将肺炎克雷伯菌粘液拉丝实验为阳性，且引起患者感染并伴全身转移的菌株鉴定为高毒力肺炎克雷伯菌。故，现在普遍使用拉丝实验作为判断肺炎克雷伯菌临床分离株是否为高毒力肺炎克雷伯菌的粗略筛选实验，但前期研究结果证实，临床上并不是所有高毒力肺炎克雷伯菌都具有高粘液性特征，因此，不能仅凭高粘液型鉴定高毒力。

论文文献“高毒力肺炎克雷伯菌的研究进展，邱世洁等，2018年3月”中记载：目前尚无金标准对高毒力肺炎克雷伯菌做出初步的鉴定，大部分实验室仅通过拉丝试验初步判断是否为高毒力肺炎克雷伯菌，具体为：使用接种环轻触琼脂平板上过夜培养的菌落，若有黏液丝并拉丝长度大于5mm即可初步判断为高毒力肺炎克雷伯菌。但目前仍不清楚是否所有的高毒力肺炎克雷伯菌都表现出高黏液性；以及认为在高毒力肺炎克雷伯菌中编码RmpA/RmpA2的主要有两个基因，分别为染色体上的c-rmpA基因及质粒上的p-rmpA/p-rmpA2基因。

论文文献“医院内高黏液性肺炎克雷伯菌的流行分布、毒力基因及临床特征分析，田李均等，2017年1月”中记载：高毒力肺炎克雷伯菌在琼脂平板的菌落生产表现为高黏液性，通过拉丝实验半定量定义。虽然是否所有的高毒力肺炎克雷伯菌都具有高黏液性目前仍不清楚，但是由于高黏性特征与引起侵袭性感染的肺炎克雷伯菌的毒力密切相关，且缺乏其他特异性的诊断指标，故目前多数研究仍将拉丝试验阳性作为高毒力肺炎克雷伯菌的一个诊断指标。

发明内容

发明人在研究中发现一组不具有高粘液性特征（即非粘液型）、动物实验呈现高死亡率的肺炎克雷伯菌，同时，临床信息也显示感染这一组肺炎克雷伯菌的病人也呈现高死亡率，即表现为高毒力；采用比较基因组学法，得知：这一组高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的基因组中含有ampR基因，而其他低毒力特征的非粘液型肺炎克雷伯菌不含有ampR基因，因此，基于这一研究结果，将ampR基因作为生物标志物，设计特异性引物且应用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒中。