[发明专利]一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗

说明书

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗。该非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗的主要原料为非洲猪瘟融合蛋白，本发明的非洲猪瘟融合蛋白包括选自p72蛋白的片段、选自p54蛋白的片段和选自p30蛋白的片段；所述选自p72蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.1所示的序列，所述选自p54蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.2所示的序列，所述选自p30蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.3所示的序列。该非洲猪瘟融合蛋白具有免疫效果好等优点。

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗。

背景技术

非洲猪瘟(ASF)自2018年8月传入我国，现已严重影响了畜牧业的发展和人民的生活。该病从1921年被发现至今近百年，但目前全球尚无获批疫苗和特效药。随着现代生物学的发展，ASF疫苗研发取得了较大的研究进展。鉴于现有的研究，开发有效的灭活ASF疫苗似乎不太可能。现研发方向主要集中在减毒疫苗、病毒活载体疫苗、亚单位疫苗以及核酸疫苗等。

减毒活疫苗具有能有效激活机体免疫系统的优点，主要分为传统减毒和重组减毒活疫苗，但这两类疫苗都存着毒力返强的可能性，均不是高安全性的首选；尤其是传统减毒活疫苗，如使用不当可能会衍生出新的强毒。核酸疫苗可产生持久性的免疫应答，但目前安全性及有效性无法保证。病毒活载体疫苗相对于减毒活疫苗虽较安全，但现阶段还缺乏对其长期安全性、有效性的研究，且活载体疫苗多采用细胞表达，成本高。

亚单位苗包括：传统方式是采用微生物培养后用物理和化学方法提取有效抗原成分制成疫苗；现代生物学方法是将病原的基因和蛋白进行分析后，利用基因工程技术将病原保护性抗原基因序列插入合适的表达质粒，高效稳定表达，生产抗原制成亚单位疫苗。亚单位疫苗是公认最安全的疫苗，但ASFV编码多达170种蛋白质，因此很难选择可诱导保护的抗原，目前已经研究报道了几种ASFV蛋白是ASFV的中和位点，并对这些蛋白质的免疫保护能力做了测试。但由于不能很好地刺激细胞免疫以及中和位点中多个空间构象难以保持正确形态的问题，效果均不理想。

非洲猪瘟疫苗研发的难点在于病毒基因组大，蛋白多，结构复杂，难大规模培养，传代易变异，病毒免疫逃逸机制不清，且毒株使用对研究硬件要求高。截至2019年9月1日，国内除农业部下属的哈尔滨兽医研究所有条件进行减毒、基因缺失苗的研发外，其他研究机构均缺少必要的研究硬件，亚单位苗的研发成为其他团队唯一可行的选择。而非洲猪瘟亚单位苗研发的难点在于如何有效的激活猪的细胞免疫、产生高水平的中和抗体并避免某些抗体加速病毒感染(ADE效应)。

文献《Neutralizing antibodies to African swine fever virus proteinsp30,p54,and p72 are not sufficient for antibody-mediated protection》J.G.Neilan等，《Virology》319(2004),P337-342)公开了用杆状病毒表达致病性ASFVPr4株的p30、p54、p72和p22蛋白免疫猪，在免疫组动物中检测到ASFV特异性中和抗体，但用104TCID50剂量的Pr4攻毒，免疫组和对照组的所有动物在7-10DPI之间死亡，表明针对上述蛋白的中和抗体不足以进行抗体介导的保护。

中国专利文献CN 103172749A公开了一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备，该非洲猪瘟蛋白工程疫苗通过利用基因重组技术，将非洲猪瘟重要结构蛋白p72、p54以及红细胞凝集素HA多个T细胞表位和纯化标签串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备得到具有细胞免疫和体液免疫效果的非洲猪瘟蛋白工程疫苗，用于非洲猪瘟疫情的防控。该蛋白不含有目前主流研究公认的重要抗原P30，在免疫时，理论上存在保护抗体谱窄的问题。另外，重组蛋白对体液免疫刺激不足的问题也没有通过设计进行解决，存在一免后抗体效价较低的问题。

发明内容