[发明专利]一株生产猪α-干扰素的工程菌及其应用

说明书

本发明涉及猪干扰素的发酵生产，具体涉及一株生产猪α‑干扰素的工程菌及其应用。所述工程菌含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码猪α‑干扰素的基因，其保藏编号为CCTCC M 2019749。使用本发明的工程菌进行发酵生产，能够在不改变发酵工艺的情况下，使重组猪α‑干扰素的产量高达11.23g/L，在原有基础上提高了35.09倍。

技术领域

本发明涉及猪干扰素的发酵生产，具体涉及一株生产猪α-干扰素的工程菌及其应用。

背景技术

我国是世界养猪大国，2018年出栏超69382万头，每年因病毒性疾病的爆发，给生猪养殖业造成上百亿元损失。急需寻求一种高效、安全以及无毒副作用的猪病毒性疾病防治新产品。目前市场上使用最多的是猪白细胞干扰素，由四川世红生物技术有限公司通过诱生方法生产，于1997年获得农业部新兽药证书[(97)新兽药证字第01号]。目前利用大肠杆菌和毕赤酵母成功地表达出重组干扰素，但是至今在我国未有猪重组干扰素获得新兽药证书，也未有进口的猪重组干扰素获得进口注册证书。

重组猪α-干扰素在宿主菌分泌表达时，常会发生信号肽切除不完全、分泌产物表达不均、高密度发酵时表达产物降解以及糖基化程度偏大、高甘露糖基化等问题，这导致重组猪α-干扰素的产量较低且生产成本较高。因此，有必要筛选出新的重组猪α-干扰素高产菌，从而降低生产成本，减少因病毒性疾病导致的猪养殖业损失。

发明内容

针对微生物发酵法生产重组猪α-干扰素产量较低且生产成本较高等缺点，本发明提供一株高产重组猪α-干扰素的工程菌，为重组猪α-干扰素大规模工业化生产奠定了基础。

本发明请求保护的技术方案如下：

一株生产猪α-干扰素的工程菌，其特征在于：其保藏编号为CCTCC M 2019749；所述工程菌含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码猪α-干扰素的基因。

上述生产猪α-干扰素的工程菌在制备用于治疗猪病毒性疾病的产品中的用途。

一种菌剂，其特征在于：包含上述生产猪α-干扰素的工程菌。

所述菌剂在制备用于治疗猪病毒性疾病的产品中的用途。

在一些实施例中，所述猪病毒性疾病包括高致病性蓝耳病、仔猪病毒性腹泻和猪口蹄疫。

编码猪α-干扰素的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种表达盒，其特征在于：包含上述基因。

一种载体，其特征在于：包含上述基因或上述表达盒。

一种重组细胞，其特征在于：包含上述基因或上述表达盒或上述载体。

一种生产猪α-干扰素的方法，其特征在于：培养上述生产猪α-干扰素的工程菌或上述重组细胞，诱导产生猪α-干扰素。

我们在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上找到山猪α-干扰素蛋白序列，删除了山猪α-干扰素原有的信号肽，并对其具有简并密码子的氨基酸进行统计分析，选择使用频率高的密码子，得到新的重组猪α-干扰素序列。通过基因合成，获得了新的重组猪α-干扰素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将新基因插入到分泌型多拷贝pPICZaA表达载体上并转染到毕赤酵母中，再采用含有高浓度的博来霉素的平板进行筛选，获得了重组猪α-干扰素分泌能力显著提高的毕赤酵母菌。

将本发明筛选的毕赤酵母菌应用于重组猪α-干扰素的微生物发酵法生产，能够在不改变生产过程，工艺步骤，培养条件的情况下，使微生物发酵法生产重组猪α-干扰素的能力在原有基础上提高35.09倍，重组猪α-干扰素的产量高达11.23g/L，适合重组猪α-干扰素的大规模工业化生产，具有很高的应用价值和工业实用性。