[发明专利]BAK细胞及其制备试剂盒和制备方法

说明书

本发明涉及肿瘤免疫技术领域，具体涉及BAK细胞及其制备试剂盒和制备方法。本发明提供的BAK细胞制备试剂包括试剂I、试剂II和试剂III；其中，试剂I包含抗人CD3单克隆抗体和/或赫赛汀；试剂II包含选自唑来膦酸、粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子、干扰素γ、白介素2中的一种或多种；试剂III包含选自粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子、干扰素γ、白介素2中的一种或多种。本发明还提供制备BAK细胞的方法。本发明的BAK细胞制备试剂和制备方法可有效减少单个核细胞的活化步骤，简化制备工艺，利用较少的活化试剂可得到大量高质量、具有广泛高效的肿瘤细胞杀伤活性且安全性高的BAK细胞，具有较高的经济性和应用价值。

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫技术领域，具体涉及BAK细胞的制备试剂、试剂盒、利用该试剂或试剂盒制备BAK细胞的方法以及利用该方法制备得到的BAK细胞及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是继心血管疾病之后的危害人类健康的第二号杀手，近年来，肿瘤的发生率和死亡率呈逐年上升的趋势，且肿瘤发病呈现年轻化趋势。恶性肿瘤的传统疗法包括手术、化疗和放疗等，但是这些治疗手段都存在一定的局限性：手术治疗常因癌细胞浸润到邻近或转移到远端组织而不能根除；化疗、放疗则在杀伤癌细胞的同时亦累及到正常组织和正常细胞，不同肿瘤对放、化疗的敏感性存在较大差异，同时会发生严重的毒副作用，这些均限制了放化疗的临床疗效。

随着人们对肿瘤发生发展机制的深入研究及肿瘤免疫学、分子生物学、生物工程技术的发展，肿瘤的免疫治疗迅速发展成为肿瘤治疗的第四种治疗模式。免疫治疗可以单独使用，也可以与现代手术、化疗和放疗方法联合应用，具有很强的互补作用，不但能够清除体内不同部位的微小或残留肿瘤细胞，预防肿瘤复发与转移，而且对病人受损的免疫系统又能起到恢复与重建的独特作用。

免疫治疗包括肿瘤疫苗治疗、细胞因子治疗、过继性细胞免疫治疗及单克隆抗体免疫治疗等，其中，过继性免疫细胞治疗成为当前研究的热点，淋巴因子活化的细胞(Lymphokine activated killer,LAK)即是一种为癌症患者提供过继性免疫细胞的治疗技术，该治疗技术为采集患者外周血，提取外周血单个核细胞，后经与白介素2(Interleukin2,IL-2)共孵育，最后将IL-2与活化的细胞回输患者。然而，接受LAK细胞治疗的患者会发生严重副作用，使得患者对治疗并不满意。因此，肿瘤浸润淋巴细胞(Tumorinfiltrating lymphocyte,TIL)治疗技术随之得到发展，该技术需要从癌症患者体内采集肿瘤组织，在体外从实体肿瘤组织中提取淋巴细胞，经IL-2刺激后，将活化后的淋巴细胞与IL-2同时回输患者。该治疗技术的缺点是必须通过临床无菌手术切取患者肿瘤组织，体外操作比较复杂，且在施用过程中同样会产生副作用。随后，美国斯坦福大学的Schmidt Wolf教授于1991年首次报道了使用细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokines induced killercells，CIK)进行癌症的辅助治疗，CIK细胞是将人外周血中的单个核细胞在多种细胞因子，如CD3单克隆抗体、IFN-γ、IL-2、IL-15等的作用下，经扩增培养获得的一群异质性混合细胞，该混合细胞中主要效应细胞为CD3⁺CD56⁺细胞(同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子)，因CD3分子是T细胞的表面标志，CD56分子是NK细胞的表面标志，所以又被称为NK细胞样T淋巴细胞，即NKT细胞，因此，具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和自然杀伤细胞的无MHC限制性的广谱杀瘤、抗病毒活性的优点。后续临床上又尝试使用细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocytes,CTL)，细胞毒性T淋巴细胞是一种肿瘤特异性CD8阳性T淋巴细胞，该细胞为主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)限制性T细胞，需使用自体或异体交叉反应性肿瘤刺激外周血单个核细胞进行生产制备。但该治疗技术同样需要切取患者自体肿瘤组织或者人工合成肿瘤相关性抗原刺激T淋巴细胞，所获得的肿瘤特异性CTL细胞识别癌细胞必须依赖MHC-I分子，而大多数癌细胞在增殖过程中通常会通过低表达或者不表达MHC-I分子，从而发生免疫逃逸，因此，肿瘤特异性CTL在实际使用过程中对于逃逸的癌细胞同样也束手无策。