[发明专利]基于CRISPR的改变基因产物表达的方法及其应用

说明书

本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种基于CRISPR的改变基因产物表达的方法及其应用。所述方法包括提供包含一种或多种载体的非天然存在的核酸酶系统，所述载体包含i)选自SEQ ID NO:1～9中至少一种的编码核酸酶系统指导RNA或其前体物的核酸序列，以及任选的ii)编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列；所述指导RNA靶向靶DNA，且所述核酸酶切割所述靶DNA以改变基因产物的表达。该方法能够同时改变IL1R11、TNFR1以及TNFR2三个基因的基因产物的表达。

技术领域

本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种基于CRISPR的改变基因产物表达的方法及其应用。

背景技术

近几年基因编辑技术获得突破性发展，尤其是第三代基因编辑技术CRISPR更具有明显的优势，如构建简单，效率高，操作简便等。CRISPR系统一般包括以下几个部分：(1)PAM位点，位于靶序列的下游，只有几个nt(例如spCAS9/NGG；saCAS9/NNGRRT)，根据此位点来选取靶序列；(2)靶序列，识别并与切割位点结合的序列，一般在20nt左右；(3)TracRNA，连接与靶序列之后的一段回文RNA序列；(4)Cas9内切酶，具有独立酶活性。Cas9含有2个独特的活性位点，分别为氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH。Cas9中的HNH活性位点剪切gRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链。Nickase(切口酶)为Cas9蛋白的突变体，其RuvC或HNH尖性位点失活，使其只能切割目的序列的其中一条DNA链，从而形成DNA单链切口。CRISPR的工作原理通常为，sgRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的活性位点剪切DNA的两条链或一条链，最终引入DNA双链断裂(DSB)或单链断裂(SSB)。DSB有两种修复方式：一种是非源末端连接(NHEJ)，一种是同源重组(HR)，当同源重组片段存在的情况下倾向于后者。SSB有两种修复方式：一是以未断裂的互补链为模板进行修复，一种是在同源重组片断存在的情况下以同源重组的方式进行修补。利用上述原理可以对特定的基因进行突变敲除或定点编辑，相较于目前普遍采用的随机整合，定点基因编辑的安全风险更加可控。

IL-1β是许多风湿性关节炎的致病因子，因此它也是最受关注的IL-1家族成员。

IL-1家族成员包括：IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36Ra、IL-37、IL-38。其中IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36γ是促炎性因子，而IL-1Ra、IL-36Ra、IL-37、IL-38是抗炎性因子。

IL-1β首先与IL-1R1受体结合，导致IL-1R1结构发生改变，然后IL-1β/IL-1R1复合物再结合IL-1R3，形成IL-1β/IL-1R1/IL-1R3聚合体，激活NF-κB通路。与不同的配体结合，IL-1R1会发生不同的变构现象。抗炎性因子IL-1Ra结合IL-1R1后，IL-1R1同样变构，但变构后的IL-1R1不再结合IL-1R3，抑制了NF-κB通路。IL-1β同样可以结合IL-1R2，但这个受体缺乏胞内区域，不能产生任何信号传导。