[发明专利]能够满足谷子杂交种纯度鉴定要求的单粒醇溶蛋白提取方法

权利要求书

1.能够满足谷子杂交种纯度鉴定要求的单粒醇溶蛋白处理方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

A、谷子单粒醇溶蛋白的提取；

A-(1)样品的准备：选取120粒饱满的谷子杂交种种子及其母本、父本种子各8粒，每粒种子分别装入1个内壁光滑的小纸袋中，做好标记；然后将种子砸成粉末状，将粉末放置于2.0ml离心管中；

A-(2)配制谷子醇溶蛋白提取buffer，如下表1：

1.谷子醇溶蛋白提取buffer配方

A-(3)向每个装有谷子粉末样品的离心管中，加入谷子醇溶蛋白提取buffer 50μl，盖好盖子，涡旋震荡混匀，放入65℃烘箱过夜；

A-(4)取出步骤A-(3)中的离心管，放入离心机，严格配平，12000rpm，离心10min；

A-(5)取新的1.5ml离心管，并在离心管中加入15μl A-PAGE loading buffer，配方如下表2：

2.A-PAGE loading buffer配方

A-(6)分别用移液枪取步骤A-(4)制得的上清液30ul加入步骤A-(5)制得的装有A-PAGEloading buffer的离心管中，依次编号，确保顺序编号一致；离心1min，涡旋震荡混匀，然后用瞬时离心机调平离心1min，放入冰箱过夜，低温促进醇溶蛋白析出与loading结合，即可提取到能够满足谷子杂交种纯度鉴定要求的醇溶蛋白；

B、醇溶蛋白多态性检测；

操作步骤包括：

B-(1)将电泳用的耳板和大板仔细清洗干净；

B-(2)配制凝胶，配方见表3、表4，配置前将烧杯、量筒洗刷干净，并配制好FeSO₄工作液，即FeSO₄0.04g+1ml ddH₂O；

3.1L凝胶buffer配方

4.凝胶配方：100ml，2板胶

B-(3)首先检查步骤B-(1)清洗的玻璃板是否干净，然后将玻璃板耳板与大阪拼合，耳板朝外，安装到做胶架上，并用长尾夹固定到做胶架上，双面安装好后，放到封底架上，封底；

B-(4)检查梳子是否干净，确保梳齿上无胶粒，并用毛巾擦干，确保无杂物；

B-(5)配制H₂O₂工作液：将30％的H₂O₂储存液剧烈晃动混匀，吸取出200μl加入三角瓶中，并加入2ml ddH₂O，混匀；

B-(6)将步骤B-(2)中配置好的凝胶用玻璃棒再次搅动、混匀，检查药品是否充分溶解，混匀后分装到2个干净的100ml的烧杯中，记为烧杯A和烧杯B；

B-(7)用移液枪上下吸吹混匀步骤B-(5)配制的H₂O₂工作液，然后吸出150μl H₂O₂工作液，加入到步骤烧杯A中，轻轻晃动混匀，迅速倒入安装好的玻璃板中，倒满后插入梳子；

B-(8)上下吸吹混匀步骤B-(5)配制的H₂O₂工作液，然后吸出150μl H₂O₂工作液，加入到烧杯B中，轻轻晃动混匀，迅速倒入安装好的玻璃板中，倒满后插入梳子；

B-(9)配制20X电极buffer，配方见表5，用量筒取50ml 20x电极buffer，加入量杯中，并在量杯中加入950ml ddH₂O，置于磁力搅拌器上混匀；

5.1L 20X电极buffer配方

B-(10)步骤B-(7)、B-(8)的胶体凝固后，拔下梳子，打开封底架，拆下长尾夹，耳板朝内，将玻璃板安装到电泳仪上，四个角的螺丝均匀上紧，然后将安装好的电泳仪放置到电泳槽内；

B-(11)关掉步骤B-(9)的磁力搅拌器，并用将该步骤配制的1X电极buffer倒入步骤B-(10)准备的电泳仪上的槽中，检查是否漏液，确保不漏液后，再在下槽中加入步骤B-(9)制备的1X电极buffer，确保介于最低和最高线之间；

B-(12)将电泳仪与冷凝管连接，打开长尾夹，开启冷凝系统，在确保电泳仪为“run”的状态下，设定温度24℃；

B-(13)检查步骤B-(12)各种设定准确无误后，从左到右依次上样10μl，各板的顺序均为15个杂交种、2个母本、2个父本、15个杂交种，加样后，接上电极；在500v电压下，电泳1h30min；

B-(14)完成电泳后，关掉电泳仪电源，关掉冷凝系统，用长尾夹夹住冷凝管，关闭冷凝系统进出水，然后卸下冷凝管；导出上槽中的电泳液，放置于垃圾桶中，然后用长尾夹关闭上槽导液管，缓慢松开固定螺丝，卸下玻璃板；

B-(15)小心剥离步骤B-(14)的耳板，将带胶大板，放入白瓷盘中，记好顺序，倒入考马斯亮蓝R-250染色液，配方见表6，染色；

6.考马斯亮蓝R-250染色液配方

B-(16)步骤B-(15)染色结束后，将胶板放置到新的盒子中，记录顺序，小心加入清水，10-30min后换水，随时观察，及时拍照。