[发明专利]一种用于肿瘤治疗的重组病毒

权利要求书

1.一种用于肿瘤治疗的重组病毒，其特征在于，痘苗病毒天坛株中缺失TK基因、F4L基因、B19R基因、C10L和VGF基因中的任一种或任意两种，得到重组病毒。

2.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，当痘苗病毒天坛株中缺失TK基因，得到缺失TK基因的重组病毒时，所述缺失TK基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：

1)将gRNA1、gRNA2和gRNA3导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2和Lenti-delNLS-gRNA3；

所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；

所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述gRNA3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

2)将所述步骤1)得到的Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2和Lenti-delNLS-gRNA3转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；

3)将所述步骤2)得到的感染293T细胞转染pJ2R-EGFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；

4)将所述步骤3)得到的病毒悬液感染Vero细胞，在绿色荧光下，挑取绿色荧光噬斑，得到带有绿色荧光基因的重组病毒，删除绿色荧光基因后，得到缺失TK基因的重组病毒。

3.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，当痘苗病毒天坛株中缺失F4L基因，得到缺失F4L基因的重组病毒时，所述缺失F4L基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：

a、将gRNA4、gRNA5和gRNA6导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6；

所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；

所述gRNA4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述gRNA5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述gRNA6的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

b、将所述步骤a得到的Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；

c、将所述步骤b得到的感染293T细胞转染pF4L-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；

d、将所述步骤c得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到缺失F4L基因的重组病毒。