[发明专利]一种放射性肺损伤体外细胞模型及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种放射性肺损伤体外细胞模型，其特征在于，所述放射性肺损伤体外细胞模型由以下方法构建：

a.复苏人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞；

b.传代培养人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞；

c.采用6MV X射线10Gy单次照射步骤b处理后得到的A549细胞，剂量率为2Gy/min，并在照射后继续培养第12h-24h内检测放射性肺损伤相关指标。

2.根据权利要求1所述的放射性肺损伤体外细胞模型，其特征在于，步骤a的具体方法为：

(1)从液氮中取出待复苏的A549细胞株，放入37℃水浴中使之溶解得到已溶解的第一细胞液；

(2)将步骤(1)得到的已溶解的第一细胞液立即移入离心管中，并加入培养基，1000rpm，离心5min，得到第二细胞液；

(3)将步骤(2)得到的第二细胞液去上清，然后加入培养液重选细胞后，按照步骤(2)的方法再次离心，得到第三细胞液；

(4)将第三细胞液去上清，重悬后，吸进新的培养瓶中，加入5ml培养基，37℃，于50ml/LCO₂的培养箱，进行培养；

(5)次日，观察细胞状态并换液。

3.根据权利要求1所述的放射性肺损伤体外细胞模型，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：

(1)细胞克隆形成：

用一般传代方法将对数生长期的单层培养的A549细胞分散成单细胞悬液，计数；将细胞悬液按梯度倍数稀释，以2000个接种于含2mL培养液的6孔细胞培养板中，然后以“十”字方向轻轻晃动培养板，使细胞分散均匀；将细胞培养板移入CO₂孵育箱中，在37℃、5％CO₂及饱和湿度环境下，静置24h，待其贴壁；

X射线照射后，继续培养12d，弃去培养液，终止培养，用PBS小心浸洗两次；加无水乙醇5mL固定15min；弃去固定液后，加吉姆萨染色液10-30min，然后流水缓慢冲去染液，空气干燥；用肉眼直接计数克隆数，每50个以上的细胞团为一克隆，按下列公式计算：克隆形成率以及细胞存活分数：

(2)CCK-8法检测细胞增殖：人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞消化、计数、配制成浓度为5×10⁴个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板每孔加入100μL细胞悬液，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后射线照射，将照射后的实验组细胞以及对照组细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养1、6、12、24、48h；将96孔板进行CCK-8染色，λ＝450nm，测定OD值：①每孔加入10μL CCK-8，在培养箱继续培养3h；②摇床10min轻轻混匀；③调整λ＝450nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率，抑制率计算公式如下：

4.权利要求1所述的放射性肺损伤体外细胞模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

a.复苏人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞；

b.传代培养人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞；

c.采用6MV X射线10Gy单次照射步骤b处理后得到的A549细胞，剂量率为2Gy/min，并在照射后继续培养第12h-24h内检测放射性肺损伤相关指标。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤a的具体方法为：

(1)从液氮中取出待复苏的A549细胞株，放入37℃水浴中使之溶解得到已溶解的第一细胞液；

(2)将步骤(1)得到的已溶解的第一细胞液立即移入离心管中，并加入培养基，1000rpm，离心5min，得到第二细胞液；

(3)将步骤(2)得到的第二细胞液去上清，然后加入培养液重选细胞后，按照步骤(2)的方法再次离心，得到第三细胞液；

(4)将第三细胞液去上清，重悬后，吸进新的培养瓶中，加入5ml培养基，37℃，于50ml/LCO₂的培养箱，进行培养；

(5)次日，观察细胞状态并换液。