[发明专利]一种对副溶血弧菌O9血清型O抗原分子分型的LAMP检测方法

说明书

本发明涉及一种对副溶血弧菌O9血清型O抗原分子分型的LAMP检测方法。本发明以副溶血弧菌O9的O抗原基因簇内的特异基因，即wvdH为靶基因，建立了对副溶血弧菌O9的O抗原分型的四条引物，为肠道及水环境中副溶血弧菌的O抗原分型提供一条可信的途径。利用本发明的LAMP引物检测肠道及水环境中的副溶血弧菌，并且对其进行O抗原分型，具有操作简单、快速高效、高灵敏度等诸多优点。

技术领域

本发明涉及对样品中副溶血弧菌O9血清型菌株O抗原分型的LAMP技术及其制备方法。本发明还设计利用所述的LAMP引物进行检测的方法。

背景技术

副溶血弧菌，是一种革兰氏阴性菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无芽孢。是一种嗜盐性细菌。隶属于弧菌科弧菌属。副溶血弧菌在水、鱼类、含盐分较高的腌制食品及人类肠道中发现，能引起人的腹痛、呕吐、腹泻，是一种重要的肠道致病菌。目前对副溶血弧菌的分型鉴定主要根据有：细菌的形态学特征、细菌的生理生化特征、血清学反应等方法，副溶血弧菌的O抗原分型属于血清学反应的一种。由于环境和抗体的多样性，形成了O抗原的多样性，而根据O抗原的多样性可以对副溶血弧菌的不同菌株进行分型鉴定。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification）能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

其技术原理为：60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。

扩增分两个阶段：第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的F1区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。

第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板，形成DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮的扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成。周而复始，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

发明人曾申请过：对副溶血弧菌K36，K37，K68特异的核苷酸及其应用；对副溶血弧菌K36，K37，K68特异的核苷酸及其应用。本申请和已经公开的专利申请的区别在于：检测手段不再利用基因芯片(因扩增和杂交分开进行，时间稍长)，而是利用LAMP技术检测（一步反应扩增检测，简单快速，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本低）。

发明内容

为实现上述目的，本发明公开了一种对样品中副溶血弧菌O9血清型O抗原分型的LAMP引物，该引物含有FIP 引物、F3引物、BIP引物以及B3引物。