[发明专利]一种同时制备两种单克隆抗体的方法

说明书

本发明公开了一种同时制备两种单克隆抗体的方法，所述方法以33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物作为抗原免疫小鼠，选取免疫后抗体水平较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，再通过33F肺炎多糖、乙肝表面蛋白以及33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白偶联物作为抗原进行特异性筛选，获得杂交瘤细胞，同时制备出特异性识别33F肺炎多糖和乙肝表面蛋白的单克隆抗体。本发明这种以乙肝表面蛋白为载体的肺炎偶联物免疫后同时制备分别针对多糖与蛋白的单克隆细胞株细胞及特异性单抗的方法，节省了工作量，提高筛选效率，同时本发明提供的两种单抗具有特异性高，敏感度高及传代稳定性好的优势。

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其涉及一种同时制备两种单克隆抗体的方法。

背景技术

肺炎球菌和乙肝病毒是危害人类健康的两大病原微生物。针对肺炎球菌和乙肝病毒的 疫苗的成功上市为预防和控制该类疾病提供了有效手段。而在这两种疫苗研发和生产的过 程中需要通过对有效抗原成分的测定来进行质量控制。在抗原含量的检测上，目前，肺炎 疫苗的抗原含量主要采用化学基团法进行测定，通过化学基团的理论比例来判断其含量。 不能完全体现其生物活性。与传统的理化方法相比，利用抗原和抗体在体外特异性结合的 方法，对样品中的抗原进行定性或定量检测更具有特异性。而现有的肺炎血清国际标准品 是一种来自于人类的多抗血清，且数量有限，对不同的型别的适用情况需要进行实验摸索 及验证。因此，单克隆抗体由于针对抗原表位的唯一性已成为继多克隆抗体后更为敏感和 有效的手段而应用于抗原的检测中。

虽然，已有用偶联疫苗进行流脑多糖单克隆细胞株和抗体制备的研究报道，但并未见 同时将偶联蛋白单克隆细胞制备工作和多糖抗原单克隆细胞制备一起考虑的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种通知制备两种单克隆抗体的方法，本发明通过 一个实验能同时筛选出针对多糖和载体蛋白的单克隆抗体，节省了工作量，提高了筛选效 率。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种同时制备两种单克隆抗体的方法， 所述方法以33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物作为抗原免疫小鼠，选取免疫后抗体 水平较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，再通过33F肺炎多糖、乙肝表面蛋白以 及33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物作为抗原进行特异性筛选，获得杂交瘤细胞， 同时制备出特异性识别33F肺炎多糖和乙肝表面蛋白的单克隆抗体。

进一步地，所述方法具体步骤如下：

步骤(1)将33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物抗原与弗氏佐剂混匀后进行免 疫小鼠，最后一次免疫后7天于眼眦采血，分离血清，检测OD₄₅₀吸光值，筛选OD₄₅₀吸 光值最高的小鼠分离脾淋巴细胞用于后续融合；

步骤(2)将小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合，加入PEG4000进行细胞融合，融合后将细胞按有限稀释法稀释后接种于96孔培养板中，用含10％胎牛血清的HAT选择 培养基进行选择培养得到融合细胞；

步骤(3)融合细胞经有限稀释并培养至单层时，吸取细胞上清，对细胞上清初筛选用33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白偶联物进行细胞上清抗体效价检测，复筛再分别进行抗33F型肺炎多糖和抗乙肝表面蛋白的抗体效价检测，挑选阳性孔进行有限稀释后直至阳性率达到100％，分别选取抗33F肺炎多糖阳性孔和抗乙肝表面蛋白阳性孔中OD₄₅₀值最高的细胞进行扩大培养；

步骤(4)将筛选出的细胞株扩大培养后，制备小鼠腹水，并分别针对筛选出的细胞株做特异性鉴定，得到分别特异性识别33F型肺炎多糖和33F型肺炎多糖的单克隆抗体及相应的杂交瘤细胞株。

进一步地，所述33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白偶联物免疫小鼠时免疫过程如下：以 0天-14天-28天三针的方式进行免疫，免疫剂量为1μg/次·只，免疫部位为腹股沟皮下免疫。