[发明专利]一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用

说明书

本发明公开了一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用，属于基因工程和生物技术领域。该分泌载体是将编码信号肽SP_phoD的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1)和编码分子伴侣PrsA的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.3)分别连接到pMA5‑P43上构建分泌质粒pMA5‑SPP。以pMA5‑SPP为载体，在枯草芽孢杆菌中表达L‑天冬酰胺酶，其胞外分泌量占总表达量的38％，胞外分泌量是常见信号肽SP_pel介导下分泌量的2.95倍。

技术领域

本发明涉及一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用，属于基因工程和生物技术领域。

背景技术

在利用微生物进行表达重组蛋白的过程中，良好的分泌性能降低产品回收成本，是重组蛋白能否进行工业生产的重要考量因素。信号肽是分泌蛋白N端的一段能介导蛋白分泌到胞外的肽链，对蛋白的分泌表达具有重要意义。分子伴侣在细胞中能识别并结合到不完整折叠或装配的蛋白，帮助这些蛋白进行折叠、分泌(Molecular microbiology,2010,8(4):727-37；Microbial cell factories,2015,14,92)。因此，在构建蛋白的分泌表达载体中，选择合适的信号肽及分子伴侣具有重要的意义。

枯草芽孢杆菌由于缺少细胞外膜而具有良好的分泌能力，是分泌生物制品的理想宿主。同时，枯草芽孢杆菌还具有食品安全性、基因信息清楚良好的生产技术和发酵基础等特性，因此被广泛应用于蛋白、食品添加剂、抗生素的生物发酵制备当中(Trends inbiotechnology,1992,10(7):247-56；Journal of clinical microbiology,1998,36(1):325-6；Nature,1997,390(6657):249-56.)。

以枯草芽孢杆菌为宿主菌分泌表达外源蛋白的过程中，构建含有有效的信号肽及分子伴侣的载体对蛋白的分泌具有重要意义。目前没有同时在载体上构建信号肽SP_phoD基因及分子伴侣PrsA基因以提高枯草芽孢杆菌蛋白的分泌水平的文献报道。

L-天冬酰胺酶胞外分泌的相关报道相对较少，有研究表明，以枯草芽孢杆菌168为宿主菌，表达B.subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶，胞外酶活占总酶活的57.1％(JournalOf Agricultural And Food Chemistry,2013,61(39):9428-9434)，但重组酶酶活只有9.98U/mL。以枯草芽孢杆菌168为宿主菌，表达Pyrococcus yayanosii来源的L-天冬酰胺酶，胞外、胞内酶活分别为23.31U/mL、65.72U/mL(Scientific Reports,2018,8(1):7915)，酶活水平有限。

因此，提供一种进一步提高L-天冬酰胺酶胞外分泌水平的方法，对于工业制备L-天冬酰胺酶有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌表达载体，是将编码信号肽SPphoD的基因和编码分子伴侣PrsA的基因连接到载体pMA5-P43上，得到表达载体pMA5-SPP；所述信号肽SPphoD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子伴侣PrsA的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。在本发明的一种实施方式中，将所述编码信号肽SPphoD的基因连接到载体pMA5-P43的多克隆位点EcoR V和Kpn I之间，在P43启动子的介导下表达，并将所述编码分子伴侣PrsA的基因连接到载体pMA5-P43的多克隆位点BamH I和Mlu I之间，在PpHpaII启动子的介导下表达。

所述pMA5-P43质粒是利用酶切连接将启动子P43连接到pMA5载体上得到的。