[发明专利]用于检测核酸PAP扩增的焦磷酸化激活性荧光

说明书

本发明涉及用于测定核酸PAP扩增的焦磷酸化激活性荧光的全新荧光检测方法。荧光基团‑淬灭基团双标记阻断性引物用于PAP反应，该引物的内部区域或5'末端核苷酸带有一个荧光基团，3'末端阻断性核苷酸则带有一个淬灭基团。多个荧光基团‑淬灭基团双标记阻断性引物也用于多重PAP反应，这些引物则带有不同的荧光基团用以区分一个反应中的多个模板。

序列表

本申请同时提交序列表。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及焦磷酸化激活性聚合反应(Pyrophosphorolysis activated polymerization,PAP)核酸扩增。

背景技术

焦磷酸化激活性聚合反应(PAP)

焦磷酸化激活性聚合反应(Pyrophosphorolysis activated polymerization,PAP)是一种使用3'末端阻断性引物，利用DNA聚合酶催化焦磷酸化反应串联耦合聚合反应的一种核酸扩增方法(Liu and Sommer,2000；Liu and Sommer,2004b)。其引物在3'末端由具有不可延伸性的核苷酸(3'末端阻断剂)如双脱氧核苷酸所封闭,因此不能直接被DNA聚合酶所延伸。当3'末端阻断性引物与其互补性DNA模板杂交时，在焦磷酸或其类似物的存在下DNA聚合酶可以去除3'末端阻断性引物上的3'末端阻断剂，这一反应称为焦磷酸化反应。然后DNA聚合酶能沿着已去除3'末端阻断剂的引物而延伸DNA模板,这一反应称为聚合反应。除了本文所引用的参考文献，PAP已经在美国专利6,534,269,7,033,763,7,105,298,7,238,480,7,504,221,7,914,995和7,919,253中所描述。

在PAP中使用了3'末端阻断性引物，使得焦磷酸化反应和聚合反应的串联耦合具有极高的选择性(Liu and Sommer,2004a；Liu and Sommer,2004b)，因为一个显著的可导致假阳性的非特异性扩增(第二类错误)需要错配性焦磷酸化反应加上随后发生的由DNA聚合酶而产生的错误掺入性延伸反应,因此这种串联错误事件的发生概率估计为3.3×10^-11。

双向形式的PAP(Bi-PAP)特别适用于等位基因的特异性扩增，它使用两个相对应的3'末端阻断性引物，其3'末端的单个核苷酸相互重叠(Liu and Sommer，2004a；Liu andSommer，2004b)。Bi-PAP可以在10⁹个野生型DNA模板存在的情况下检测到一个拷贝等位基因的突变而没有假阳性扩增。

DNA-PAP

PAP的最初测试采用了人类多巴胺D1基因DNA模板并使用了Tfl和Taq聚合酶，证明了DNA依赖性DNA焦磷酸化反应和DNA依赖性DNA聚合反应可以串联耦合(Liu and Sommer,2000)。当使用一个经过基因工程改造含有F667Y突变的DNA聚合酶TaqFS时可大大提高PAP的效率，这已被应用于其它DNA模板时所证明(Liu and Sommer,2002)。

RNA-PAP

此后发明的RNA-PAP可直接扩增RNA模板而无需额外的制备。RNA-PAP开创了RNA模板扩增的新机制，其中RNA依赖性DNA焦磷酸化反应移除了杂交于RNA模板上阻断性引物的3'末端阻断剂如3'末端双脱氧核苷酸，然后RNA依赖性DNA聚合反应则延伸被激活的引物。基于这种串联偶联，RNA-PAP对RNA模板上的不匹配的阻断性引物具有高度的选择性，导致了RNA模板的高度特异性扩增(美国专利号9,133,491)。

使用无环核苷酸为阻断剂及II型聚合酶