[发明专利]基于亚甲基蓝可控释放的免固定免标记光致电化学microRNA传感器及其应用

权利要求书

1.一种基于亚甲基蓝可控释放的免固定免标记光致电化学microRNA传感器，其特征在于，所述传感器包括光活性材料封装复合体、核酸水解酶和光致电化学检测装置，所述光活性材料封装复合体包括表面氨基化介孔二氧化硅纳米粒子NMSNs、亚甲基蓝MB和封孔核酸探针，封孔核酸探针通过静电作用吸附在NMSNs表面，并将MB封装在NMSNs内部，封孔核酸探针具有与待检测microRNA发生互补配对的碱基序列，所述光致电化学检测装置采用三电极检测体系，所用光源为单一波长光源。

2.根据权利要求1所述的免固定免标记光致电化学microRNA传感器，其特征在于，所述待检测microRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；封孔核酸探针的序列如SEQ ID NO.2所示，核酸水解酶为核酸外切酶Exo III。

3.一种利用如权利要求1或2所述的基于亚甲基蓝可控释放的免固定免标记光致电化学microRNA传感器检测microRNA的方法，其特征在于，封孔核酸探针与溶液中游离的待检测microRNA特异性结合，形成双螺旋结构，使封孔核酸探针从NMSNs表面脱离，导致MB释放到溶液中，随后核酸水解酶切割双螺旋结构中的封孔核酸探针，释放microRNA继续结合NMSNs表面的封孔核酸探针，释放更多MB，从而导致溶液中MB的浓度进一步升高，然后通过光致电化学检测获得光电流信号值变化，经数据处理后获得microRNA的存在情况和存在浓度。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A：制备光活性材料封装复合体；

B：将步骤A制备的光活性材料封装复合体分别与待检测microRNA的标准溶液、待测溶液混合，37℃恒温孵育，之后加入核酸水解酶Exo III，混匀后进行37℃恒温孵育；

C：向步骤B的体系中加入抗坏血酸溶液，将所得混合溶液作为电解质液，利用三电极体系测试光电流值；根据标准溶液的光电流变化作标准曲线，建立光电流变化值与microRNA浓度的回归方程，利用待测溶液的光电流值，计算待测溶液中的microRNA浓度。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤A中光活性材料封装复合体的制备方法包括以下步骤：

(1)取0.1～0.3g十六烷基三甲基溴化铵溶于60～150mL超纯水中，向其中加入500～1000μL NaOH溶液，在80℃下搅拌10～30分钟；取1～2mL四乙基原硅酸盐加入到上述溶液中，搅拌1～2小时，有大量白色沉淀产生；将反应产物过滤，用超纯水、甲醇分别将下层沉淀洗涤三次，干燥后即得到粗制的介孔二氧化硅纳米粒子；

(2)取0.1～0.2g步骤(1)的产品，加入1～2mL质量浓度为37％的盐酸溶液，50～100mL甲醇，回流10～20小时，然后过滤，用超纯水、甲醇分别洗涤若干次，最后在60℃条件下干燥4～8小时，获得的白色粉末即为精制的介孔二氧化硅纳米粒子；

(3)取10～30mg步骤(2)的产品，超声分散在0.5～2mL乙醇中，加入500～1000μL 3-氨基丙基三乙氧基矽烷，搅拌10～20小时，将得到的白色产物用5000～10000rpm转速离心，分别用无水乙醇、超纯水洗涤若干次，离心，取下层沉淀，干燥后得到NMSNs；

(4)取10～30mg步骤(3)的产品，加入500～1500μL浓度为1～3mM亚甲基蓝溶液中，室温下震荡6～18小时；之后加入100～200μL浓度为10～30μM的封孔核酸探针，震荡4～8小时；最后采用1000～3000rpm的转速离心，获得的下层沉淀即为光活性材料封装复合体，将其分散在0.5～2mL PBS缓冲体系中备用。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤B中，将microRNA与光活性材料封装复合体混合，在37℃孵育1～6小时，之后加入5～10U核酸外切酶，37℃孵育15～90分钟。