[发明专利]检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法

说明书

本发明涉及一种检测前列腺癌预后的试剂盒以及检测方法，采用飞行时间质谱平台检测，包括分别针对生物标记物KLHL8、FHAD1、ALKBH5、ATP11A、和/或PI15的扩增引物和延伸引物。该检测试剂盒通过首次实现了飞行时间谱平台对于DNA甲基化的多基因位点的平行检测。本发明设计了适用于质谱平台的多基因位点前列腺预后判断的甲基化检测的引物及实验方法，使之优化为多个DNA甲基化位点并行检测的低成本高通量的预后检测方法，填补了现有中国前列腺癌预后检测方法的限制。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法。

背景技术

前列腺癌是世界范围内男性发病率第2位、病死率第6位的恶性肿瘤。亚洲国家的前列腺癌发病率一直远低于欧美国家，但随着我国人口老龄化以及生活方式的改变，前列腺癌已经成为常见恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤。

由于我国前列腺癌的筛查体系尚未建立，这使得我国局限性前列腺癌诊断比例占40％左右，1/3左右新诊断患者为局部晚期。提高早诊率和有效治疗率或是降低我国前列腺癌的重要途径。

目前临床上诊断前列腺癌主要依靠直肠指诊、血清PSA、经直肠前列腺超声和盆腔MRI检查，CT对诊断早期前列腺癌的敏感性低于MRI。因前列腺癌骨转移率较高，在决定治疗方案前通常还要进行核素骨扫描检查。确诊前列腺癌需要通过前列腺穿刺活检进行病理检查。

前列腺癌的恶性程度可通过组织学分级进行评估，最常用的是Gleason评分系统，依据前列腺癌组织中主要结构区和次要结构区的评分之和将前列腺癌的恶性程度划分为2-10分，分化最好的是1+1＝2分，最差的是5+5＝10分。

由于血清前列腺特异抗原(PSA)的使用方式和诊断策略是在欧美人群中制定出来的，对于亚洲人群的研究虽然验证了其诊断效能，但在临床应用中也发现了一些差异。我国、日本及韩国的学者均发现亚洲健康人群的PSA正常参考值明显低于欧美人群，因此PSA在中国人群中的诊断效并不理想。基于Gleason评分系统的判别在7分区间区分前列腺癌的恶性程度及预后评估上有很大的局限性。

基于PCR平台的现有产品使用多个RNA表达生物标记物的检测的方法受限于RNA的降解等因素，同时检测通量低，成本高。效用对于中国人群有待验证。

一些研究发现，多个DNA甲基化的生物标记物在欧美人群中与膀胱癌的预后良恶性密切相关。而目前常用检测DNA甲基化的方法包括甲基化芯片技术、全基因组甲基化测序技术、焦磷酸测序法和质谱法。甲基化芯片技术虽然能够同时检测大量的CpG位点，但不能达到单碱基分辨。全基因组甲基化测序法成本高且数据分析量庞大。焦磷酸测序法通量低，无法实现多基因位点并行检测。而现有的质谱法对于甲基化的检测仅能局限在单个基因的多位点检测，检测过程涉及体外转录，步骤繁琐，分析过程复杂，不适用于多个基因的甲基化单位点并行检测。

飞行时间质谱平台(MALDI-TOF)是国际通用的基因单核苷酸多态性(SNP)的研究平台，其作用原理是：先通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管,而后用瞬时纳秒(10-9s)强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器，从而建立质谱图。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法，可实现多个DNA甲基化位点并行检测的低成本高通量的预后检测。

实现上述目的的技术方案如下。